－－－——１４９４。＿＿—— Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉａｂ Ｄｉａｇｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００８，Ｖｏｌ ｌ２，Ｎｏ．１２ 文章编号：１００７—４２８７（２００８）１２—１４９４—０３ ＨＣＶ细胞感染模型的建立 陈佳玉 ，陈佳琪 ，金显云。 （１．台州学院医学院检验系，浙江台州３１８０００；２．长春医学高等专科学校，吉林长春１３００３１； ３．台州学院医学院检验专业，浙江台州３１８０００） 摘要：目的研究人宫颈癌细胞（Ｈｅｌａ）对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的易感性，建立ＨＣＶ细胞感染模型。方法将Ｈｅｌａ 细胞与慢性ＨＣＶ患者血清共同温育８ ｈ，收集不同时间点标本，用逆转录聚合酶链反应（ａＴ－ｍＲ）法分别检测细胞培养 上清液中正负链ＲＮＡ，Ｓ－Ｐ法检测细胞内ＨＣＶ ＮＳ１特异性抗原的表达情况。结果结论Ｈｅｌａ细胞不但对ＨＣＶ易感，而且可以支持ＨＣＶ体外复制表达。 关键词：丙型肝炎病毒；Ｈｅｌａ细胞；感染模型 中图分类号：Ｒ３９２．１２ 文献标识码：Ａ 培养上清中可持续检测到ＨＣＶ正 ‘ 链ＲＮＡ，并可间断地检测到ＨＣＶ负链ＲＮＡ；ＨＣＶ ＮＳ１特异性抗原能在感染细胞内稳定表达，阳性物质多位于胞浆中。 Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆＨＣＶ－ｉｎｆｅｅｔｅｄ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ ＣＨＥＮ Ｊｉａ－ｙｕ，ＣＨＥＮ￣ａ－ｑｉ，ＪＩＮ Ｘｉａｎ－ｙｕｎ．（Ｔａｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ， Ｔａｉｚｈｏｕ，３１８０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＨＣＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｓｕｓｃｅｐｆｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｌａ ｔｏ ＨＣＶ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｈｅｌａｗｌ舾ｉｎｃｕｂａｔｅｄｗｉｔｈ ｓｅｒｕｍｆｒｏｍ ａＨＣＶ ｐａｔｉｅｎｔｆｏｒ８ ｈｏｕｒｓ．Ｂｏｔｈｔｈｅ ｐｌｕｓ ａｎｄｍｉｎｕｓ ｓｔｒａｎｄｓ ｏｆＨＣＶＲＮＡｉｎ ＳＵ－ ｐｅｍａｔａｎｔ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ．Ｔｈｅ ＨＣＶ ＮＳ１ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｅｌｃｌｓ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｗｉｈｔ ｈｔｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏ￣ｔｏ ａｎｔｉｇｅｎ ｆ ｏｔｈｅｉｒ ｏｗｎ ｂｙ Ｓ－Ｐ ａｓｓａｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｐｌｕｓ ｓｔａｎｄｏｆＨＣＶＲＮＡＷａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ ａｎｄｍｉｎｕｓ ｓｔａｎｄｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｄ ｏｃｃａｓｉｅｏｎａｌｌｙ Ｏｉｌ ｌａｙｓ ｐｏｓｔ—ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｕｐｅｍａｔａｎｔ．ｈｅ Ｔｐｏｓｉｉｔｖｅ ｓｉ乎ｌａｌ ｏｆ ＮＳ１ ａｎｔｉｇｅｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｔｗｈｉｎ ｃｙｔｏｌａｆｓｍ ｆｏ ｉ￣ｅｃｔｄ ｅｃｅｌｌｓ．￣Ｊｑｌｄｕ・ ｓｉｏｎ Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ Ｈｅｌａ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｎｏｔ ０ｎｌｙ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｔｏ ＨＣＶ ｂｕｔ ａｌｓｏ ａｂｌｅ ｔｏ ｓｕｐｐｏｒｔ ｉｔｓ ｌｏｎｇ－ｔｉｍｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＨＣＶ；Ｈｅｌａｃｅｌｌｓ，ｃｕｌｔｕｒｅｄ；ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｍｏｄｅｌ （Ｃｈ／ｎ．，Ｌａｂ脚，２Ｏ０８，１２：１４９４） 近年来，有关ＨＣＶ的研究主要集中在以下几个 取１ ｍｌ培养上清置经ＤＥＰＣ水处理的Ｅｐ管中， 方面：ＨＣＶ基因及其产物结构与功能的分析；ＨＣＶ 的复制机制；ＨＣＶ保护性抗原的鉴定及疫苗的研 制；抗ＨＣＶ药物的筛选。上述四个方面的研究都需 要一个ＨＣＶ细胞模型。但是，由于缺乏理想的ＨＣＶ １ ０００×ｇ离心５ ｍｉｎ－￣取上清，一８Ｏ℃冰箱冻存。取 出细胞爬片，０．０１ ｍｏｌ／Ｌ的ＰＢＳ洗３次，每次３０ Ｓ， ４％多聚甲醛固定１５ ｍｉｎ，ＰＢＳ洗３次，一２０℃保存。 １．３检测 细胞模型，上述研究进展缓慢，所以建立接近ＨＣＶ 自然感染状态并能稳定支持其体外长期复制的细胞 模型是必需的。本实验采用ＨＣＶ ＲＮＡ阳性的ＨＣＶ 患者血清直接感染Ｈｅｌａ细胞的方法进行ＨＣＶ细胞 模型的构建，并通过ＲＴ－ＰＣＲ、免疫组织化学等方法 分析ＨＣＶ在体外细胞中的复制和表达状态，现报告 如下： １材料与方法 １．３．１培养上清中ＨＣＶ正、负链ＲＮＡ的检测 ①正链检测培养上清中ＨＣＶ正链ＲＮＡ的检 测采用ＲＴ－ＰＣＲ法，由北方肝胆病院完成。 ②负链检测采用ｎｅｓｔ ＲＴ－ＰＣＲ的方法 引物设计参考Ｏｋａｍｏｔｏ等［ ］：Ｐｌ ５ 一ｃｇｃｇｃｇａｃｔａｇ． ｇａａｇａｃｔｔｃ一３ ，Ｐ２ ５ 一ａｔｇｔａｃｃｃｃｃａｔｇａｇｇｔｃｇｇｃ一３ ，Ｐ３ ５＇－ａｇｇａａ－ ｇａｃｔｔｃｃｇａｇｃｇｃｇｇｔｃ一３ ，Ｐ４ ５＇－ｇａｇｃｃａｔｃｃｔｇｃｃｃａｃｃｃｃａ一３ 。 ＨＣＶＲＮＡ负链ｃＤＮＡ的合成：５ ＨＣＶ ＲＮＡ溶 液及１ Ｐ１加入ｃＤＮＡ合成反应系统，反应体系含 １０×Ｂｕｆｆｅｒ２ ｌ，２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣ１２４ ｌ，ＲＮＡｓｉｎ ｌ ，１Ｏ １．１ ＨＣＶ体外感染Ｈｅｌａ细胞 取细胞生长良好的培养瓶，移去培养基，加人 ０．２ ｍｌ的ＨＣＶ感染血清（感染组），等量的正常人血 清（对照组），加完全培养基至２ ｒＩｌｌ，３７℃培养８ ｈ，弃 上清，洗涤６—８次，留最后一次洗液待检，加入２ ｌｌ１ｌ 培养基进行培养。 ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ２ ，ＡＭＶ ＲＴ １５ Ｕ，加去离子水至２０ ，４２￣（２水浴３０ ａｒｉｎ，合成ＨＣＶ ｃＤＮＡ负链。９５℃３０ 第１次ＰＣＲ：取负链ＨＣＶＲＮＡ ５出及Ｐ１，Ｐ２各１ 加入ＰＣＲ反应体系（１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｅｒ ５ ，２５．５ ｍｉｎ彻底灭活ＡＭＶ ＲＴ。 １．２标本的收集 感染后每２天从培养瓶中收集 ，部分培养上清，从培养板收集细胞爬片。 中国实验诊断学２００８年１２月第１２卷第１２期 ・－－——１４９５・－－—— ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ４ ｙｌ，１５ ｍｒａｏｌ／Ｌ Ｍ ｌ２ ５ ，Ｔａｑ酶３ ， 加去离子水至５０ ｌ进行ＰＣＲ。 掺 一’≯ ， ‘ 岛一 螭 《 一 第２次ＰＣＲ：取上述ＰＣＲ产物５ 及Ｐ３，Ｐ４各 １ ｌ，其余条件同第１次ＰＣＲ。取１０ 第２次ＰＣＲ 产物进行２％琼脂糖凝胶电泳，扩增产物如有１４４ ｂｐ 龋 一 带者即为阳性。 １．３．２细胞内抗原表达的检测（Ｓ－Ｐ法） ＰＢＳ液漂洗细胞爬片３次，每次５ ｍｉｎ（下同）； ０．０３％Ｈ２０２一甲醇溶液３７￣Ｃ孵育１０ ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗； ２０％的正常羊血清３７℃孵育１０ ｍｉｎ，加入抗．ＨＣＶ ＮＳ１多克隆抗体，４℃孵育１２—２４ ｈ，ＰＢＳ漂洗；加生 物素标记的第二抗体，３７℃孵育１０ ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗； 加入链霉菌抗生素．过氧化物酶，３７℃孵育３０ ｍｉｎ， ＰＢＳ漂洗；ＤＡＢ显色３—５ ｍｉｎ，ＰＢＳ漂洗终止显色；苏 木素复染、无水乙醇脱水、二甲苯透明、树胶封片、显 微镜下照相。结果以细胞浆内出现棕黄色颗粒判定 为阳性。 ２结果 ＲＴ－ＰＣＲ产物电泳结果显示：培养上清中可持续 检测到ＨＣＶ正链ＲＮＡ，并可间断检测到ＨＣＶ负链 ＲＮＡ（如图１）。正常对照组和最后一次洗液均未测 出ＨＣＶ ＲＮＡ。免疫组化显示感染４天后开始有表 达ＨＣＶ ＮＳ１抗原的阳性细胞，且阳性物质多位于胞 浆中，如图２，结果证实ＨＣＶ成功感染了Ｈｅｌａ细胞， 并在其中复制和表达。 ９００ ｂｐ ７００ ｂｐ 图１ ＨＣＶ负链ＲＮＡ ＲＴ－ＰＣＲ产物电泳结果 ３讨论 丙型肝炎是由ＨＣＶ感染引起的一种传染病，在 世界范围内广泛流行。据估计全世界现有１．７亿 ＨＣＶ感染者，占全球总人口３％。不同国家ＨＣＶ感 染率有所不同，约０．１％一１０％【 。ＨＣＶ感染是慢 性肝炎、肝硬化、及肝癌的重要诱Ｎ［３ Ｊ，它严重威胁 着人类的健康，因此ＨＣＶ的防治已引起及广大 科学工作的极大重视，ＨＣＶ细胞模型的建立也迫在 眉捷。 ：‘ ≯ ∥ 膨豌． 始 擎 图２感染细胞内ＨＣＶＮＳ１抗原的 免疫组化检测结果（４０×） 理想的细胞模型应具备以下基本条件：稳定性， 即细胞在培养条件下能够稳定地复制和表达；易于 重复；高水平表达基因产物；检测方法要方便、敏感 且能定量。近年来，国内外学者在筛选ＨＣＶ体外感 染细胞模型方面的研究取得了较大进展。研究表明 ＨＣＶ是多嗜性病毒，多种细胞均可不同程度地支持 ＨＣＶ的体外复制，如胎肝细胞＿４］、外周血单个核细 胞［引、肝细胞Ｅ６］、子宫内膜细胞［ 、肝癌细胞［８，９３，这 无疑极大地开拓了人们研究ＨＣＶ的策略和途径的 选择【１０ｊ。本实验在上述研究基础上，以Ｈｅｌａ细胞为 基础，进行了ＨＣＶ感染细胞模型的构建。与胚胎干 细胞相比，Ｈｅｌａ细胞用于实验不涉及伦理问题，且易 于体外培养和扩增，因此选用Ｈｅｌａ细胞进行ＨＣＶ 模型的构建具有极大的优越性。据所用方法不同， ＨＣＶ细胞模型可分为感染模型和转染模型。近年 来，ＨＣＶ全长或近全长基因转染细胞模型和转基因 动物的研究取得了一些重要进展［１１，１２］，该模型具有 病毒复制水平较高，复制时间长的优点。但是，该模 型中的ＨＣＶ与自然感染状态下的病毒特性有很大 差别。而感染细胞模型是用ＨＣＶ阳性患者的血清 直接感染培养细胞，它更接近ＨＣＶ自然感染状态， 对研究ＨＣＶ的生物学特征，筛选抗ＨＣＶ药物及研 制ＨＣＶ疫苗均有重要价值。本研究采用ＨＣＶ患者 血清直接感染Ｈｅｌａ细胞的方法进行ＨＣＶ感染模型 的构建，Ｈｅｌａ细胞经感染后，在细胞培养上清中检测 到了正、负链ＨＣＶ ＲＮＡ，且发现在细胞内ＨＣＶ抗原 有良好的表达。因此，本实验成功地建立了可供 ＨＣＶ复制和表达的细胞感染模型，为丙型肝炎的进 一步研究打下了坚实的基础。 ， ・・・——１４９６・・・—— Ｃｈｉｎ Ｊ Ｉａｂ Ｄｉａｇｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２００８，Ｖ０ｌ １２，Ｎｏ．１２ 参考文献： ｅｎｅｈｙｍａｌ 西ｎ．６ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＳｙＴｒ￣ｏｓｉｕｍ∞Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｒｅｌａｔｅｄ ［１］ＯｋａｍｏｔｏＨ，ＳｎｇｉｙａｒｍＹ，Ｏｋａｋａ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｔｙｐｉｎｇ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｅｒｓ ｂｙ ｙ－ ｖｉｕｒｓｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，１９９９，１５８． ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｙｐｅ—ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｐｒｉｍｅｒｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｃｌｉｎｉｃａｌ ［８］宋志强，郝飞，马巧玉，等．丙型肝炎病毒体外感染人肝癌细胞 ｓｕｒｖｅｙｓ ａｎｄ ｔｒａｃｉｎｇ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ［Ｊ］．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｍｌ，１９９２，７３：６７３． 株ＨｅｐＧ２的研究［Ｊ］．中华实验和临床病毒学杂志，２００３，１７（１）： ［２］（；ｏｈｅｎ Ｊ．Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｉｔｓ ｃ［ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８５： ７７． ２６． ［９］宋志强，郝飞，闵峰，等．体外培养人肝癌细胞系７７２１中ＨＣＶ ［３］Ｗａｓｌｅｙ Ａ，Ｍｔｅｒ ＭＪ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｅｐａｉｔｉｔｓ ｃ；ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅｓ 复制和表达特性［Ｊ］．第三军医大学学报，２ＯＯＯ，２２（６）：５４９． ａｎｄ ｔｅｔｒｖ￣ｒｌｕ ｔｒｅｎｄｓ［ＪＪ．Ｓｅｍｉｎ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ，２０００，２０：１． ［１０］陈瑞烈，贺永文，高勇，等．丙型肝炎病毒感染细胞模型的实验 ［４］Ｍｏｓｈａｇｅ Ｈ，Ｙａｐ ＳＨ．Ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｈｕｒｍｎ ｈｅａｐｔｏｃｔｙｅｓ：ａ ｉｎｉｑｕｅ ｓｙｓ— 研究［Ｊ］．华中科技大学学报（医学版），２００３，３２（３）：２７３． ｔｅｍｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏ－ ［１１］Ｍａｎｉｅｈａｎ Ｅ，＆ａｔｏｉ Ｊ，ｈＴｏｍｓｏｎ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓ— ｙｇ ｉｎ ｎ１ａｎｌＪ］．Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ，１９９２，１３：４０４． ｇｅｎｅ ｉｎ ｌ／ｌｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ：ａｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍｏｄｅｌ ｓｙ￣ｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ＨＣＶ．６ｔｈ ［５］贺永文，高勇，曾令兰．丙型肝炎病毒感染外周血单个核细胞的 Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｎｏａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｅｐａｔｉｉｔｓ Ｃ＆Ｒｅｌａｘｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ， 进一步研究［Ｊ］．同济医科大学学报，２０００，２９（２）：１７４． １９９９，４５． ［６］马巧玉，郝飞，王宇明．丙型肝炎病毒体外感染正常成人肝细胞 ［１２］Ｍａｓｃｉｏｐｉｎｔｏ Ｆ，Ｇａｌｌｉｓｔａｍｐｉｎｏ Ｌ，Ｐｉｌｅｉｆ Ｐ，ｅｔ ａ１．Ｈｕｍａｎ ＣＤ８１ ｔｒａｎｓｏｎｉｃ 的初步研究［Ｊ］．中华肝脏病杂志，２００１，９（３）：１８１． ｍｉｃｅ．６ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏ１３ Ｈｅｐａｔｉｉｔｓ Ｃ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｖｉｕｒｓｅｓ． ［７］Ｐａｖｌｏｖａ Ｂ，ｃＳｈａｆＺ，Ｅｄｅｒ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ａｎｏｖｅｌ ＨＣＶ ｐｏｓｉｉｔｖｅ ｃｅｌｌｌｉｎｅ ｏｆ ｎ１ｅｓ－ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，１９９９，４４． （收稿日期：２００８—０１—１９） 文章编号：１１３０７—４２８７（２００８）１２—１４％一０３ 固定化』３一羟丁酸脱氢酶的研究 张颖，徐兆珍，于永光 （哈尔滨医科大学第一临床医学院体检中心，黑龙江哈尔滨１５０００１） 摘要：目的研究固定化 羟丁酸脱氢酶的性质及其临床应用价值。方法以壳聚糖为载体，使用戊二醛为交联 剂共价键将 羟丁酸脱氢酶固定化。结果酶蛋白偶联率为６０．９％，酶的活性回收率为５５．４％；原酶和固定化酶的 ｋｍ值分别为０．８ ｘ １０ ｇ／ｍｌ和０．５ ｘ １０Ｉ２ｇ／ｒｎＩ；原酶最适温度为３７℃，固定化酶最适温度为５０ｑＣ；原酶最适ｐＨ值为 ８．０左右，固定化酶最适ｐＨ值为７．３左右。结论由于固定化酶具有较高的热稳定性（最适５０￣Ｃ）和低温稳定性（４℃ ８个月），可在较大的温度范围和较长时间内反复使用，有利于环保和降低试剂盒的成本。 关键词：固定化酶；壳聚糖；ｐ羟丁酸脱氢酶 中图分类号：Ｒ４４６．１ 文献标识码：Ａ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ＺＨＡＮＧ Ｙｉｎｇ，ＸＵＺｈａｏ－ｚｈｅｎ，ＹＵ Ｙｏｎｇ－ｇｕａｎｇ．（ Ｐａ珈姗￡ｏｆ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ锄 Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｈａｒｂｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ １５０００１，Ｃｈ／ｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｉｔｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ印ｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｏｎ ｃｈｉｔｏｓａｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔ３－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｏｎｔｏ ｃｈｉｔｓｏａｎ，ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ｂｙ ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｕｓｕａｌｌｙ ｃｒｏｓｓ・ｌｉｋｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆｃｏｕｐｌｉｎｇ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｄ６０．９％。ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆｅＩｌｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｅｌｙ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｉｓ５５．４％．Ｔｈｅ ｋｍ ｏｆｏｒｉｇ． ｉｎａｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｉｍｍｏｂｉｉｌｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｉｓ ０．８ ｘ １０ ｇ／ｍｌ ａｎｄ ０．５ ｘ １０ ｍ１．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆｏｒｉｇｉｎａｌ ｅｎｚｙｍｅ ｉｓ ３７℃， ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ５０ｏＣ．ｈＴｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐＨ ｏｆｏｒｉｉｇｎａｌ ｅｎｚｙＩＩ￣ｉｓ ａｂｏｕｔ ８．０，ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｉｎｅ ｉｓ ａｂｏｕｔ ７．３．Ｃｏｎｄｕｓｌｏｎ Ｉｍｍｏｂｉ． ｉ１ｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｈａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｈｏｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ（ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｓ ５０℃）ａｎｄ ｌｏｗｅｒｔｅｍｐｅａｒｔｕｒｅ ｓｔａｂｉｌｉｙｔ（４℃，８ ｍｏｎｔｈｓ），ａｎｄ ｃｎａ ｂｅ ｕｓｅｄ ｒｅｐｅａｔｅｄｌｙ．ｈ ｉｓ ａｄｖａｎｃｅｄ ｔｏ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｏ ｒｅｄｕｃｅ ｔｈｅ ｃｏｓｔ ｏｆｔｈｅ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｉｎｕｎｏｂｉｌｉｚｅｄ ｅｎｚｙｍｅ；ｃｈｉｔｏｓａｎ；ｔ３－Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ （Ｃｈ／ａ．，ＬａｂＤｉｏ￣ｎ，２００８，１２：１４９６） 壳聚糖是自然界唯一的碱性多糖，是从虾、蟹的 聚糖），呈网状结构。由于其来源丰富，化学性质稳 壳蛋白中提取出来的一种氨基多糖（２氨基一１．４／３葡 定，既耐热又具有良好的机械性能，因此是固定化酶 的良好载体，在医药及工业上具有广阔的应用前 基金项目：黑龙江省科学技术厅攻关课题项目（ＮＯ．２００２２０１０１） 景［１，２３，本研究拟以戊二醛固定 ．羟丁酸脱氢酶为
