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癌基因DEK和转录因子AP_2_协同促进乳腺癌中HER2的高表达

来源：爱玩科技网

2010年　2月第30卷　第2期

文章编号:100126325(2010)0220175204

基础医学与临床

Basic&ClinicalMedicineFebruary2010Vol.30　No.2

研究论文　

α协同促进乳腺癌中HER2的高表达癌基因DEK和转录因子AP22

黄前川,曹军皓,季　蒙

(广州军区武汉总医院11检验科;21麻醉科,湖北武汉430070)

摘要:目的探讨癌基因α在乳腺癌变中的相互作用及在HER2过量表达、DEK与转录因子AP22乳腺癌变中的病

α和HER2蛋白水平之间的相关性;免疫共沉淀检测DEK理学意义。方法用Westernblot检测组织中DEK、AP22α在MDA2α的表达,和AP22MB2453乳腺癌细胞中的相互作用;通过siRNA抑制MDA2MB2453细胞中DEK和AP22α和HER2的蛋白水平之间用半定量RT2PCR和Westernblot检测HER2的表达。结果乳腺癌组织中DEK、AP22α在MDA2α的表达可协同抑显示一定的相关性,DEK和AP22MB2453细胞内有相互作用,siRNA抑制DEK和AP22α协同促进乳腺癌中制MDA2MB2453细胞中HER2mRNA和蛋白的表达。结论癌基因DEK和转录因子AP22

HER2的高表达。

α;HER2;乳腺癌关键词:DEK;AP22

中图分类号:R73412　　文献标志码:A

αOncogeneDEKshowssynergesticeffectwithtranscriptionalfactorAP22

topromoteHER2overexpressioninbreastcancer

HUANGQian2chuan,CAOJun2hao,JIMeng

(11Dept.ofLaboratory;21Dept.ofAnaesthesiology,WuhanGeneralHospitalofGuangzhouCommand,Wuhan430070,China)

αinteractioninHER2overexpres2Abstract:Objective　ToinvestigatethepathologicalsignificanceofDEK2AP22αandHER2sionandbreasttumorigenesis.Methods　TheproteinlevelofDEK,AP222inbreasttumortissueswasαinMDA2detectedbyWesternblot.TheinteractionofDEKandAP22MB2453mammarycancercellswasdetectedαonHER2expressionwasinvestigatedbybyimmuno2coprecipitation.FurthermoretheimpactofDEKandAP22siRNAinMDA2MB2453mammarycancercellsfollowedbysemi2quantitiveRT2PCRandWesternblot.Results　A

αandHER2levelsinbreastcancertissueswerefound.TheinteractionbetweencorrelationbetweenDEK,AP22αinMDA2DEKandAP22MB2453cellswasverifiedbyco2immunoprecipitationassay.DepletionofDEKandAP2αinMDA22MB2453cellbysiRNAcooperativelyrepressedHER2expressionatboththemRNAandproteinlevels.αtranscriptionalfactortopromoteHER2overexpres2Conclusion　OncogeneDEKhassynergesticeffectwithAP22sioninbreastcancer.

α;HER2;breastcancerKeywords:DEK;AP22

　　人表皮生长因子受体22(humanepidermalgrowthfactorreceptor2,HER2)是已知与乳腺癌关系

不良及特异性治疗的靶分子之一

[1-2]

α(acti2。AP22

α)为一类转录因子,它可以结合基因vatiorprotein2

组上的保守序列5′2GCCNNNGGC23′而启动基因转

最密切的人类癌基因,它的过度表达是乳腺癌预后

收稿日期:2008-04-14　　修回日期:2009-09-23

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基础医学与临床　　Basic&ClinicalMedicine

[3]

2010130(2)

录,从而参与发育、分化和凋亡等生理过程αAP22可以促进HER2基因转录达明显正相关

[6]

[5]

[4]

。收集沉淀,RIPA缓冲液洗涤3次,吸尽上清,加入SDS2PAGE蛋白上样缓冲液悬浮沉淀,100℃加热5min,离心取上清行10%SDS2PAGE和Westernblot。一抗为DEK抗体,二抗为辣根过氧化物酶标

α的结合位点,因而HER2基因启动子上有AP22

,免疫组化实验

α表达与HER2已经证实,人乳腺癌组织中AP222表

α的高表达是乳腺癌的,因此,AP22

一个重要的分子标志。最近研究发现,癌基因α的转录DEK可增强HepG2肝癌细胞系中AP22活性,虽然DEK本身不是转录因子,但是可以结合转录因子而增强其转录活性,因而被称为转录共激活物

[7]

的兔抗山羊,ECL试剂盒显色。114　siRNA实验

用Lipofectmine2000试剂分别转染对照siRNA、αsiRNA及DEKsiRNA+AP2αDEKsiRNA、AP222siRNA至MDA2MB2453细胞,48h后离心收集细胞,PBS洗涤。部分细胞用Trizol试剂提取RNA进行半

。目前DEK与乳腺癌病变的相关性未见报

α协同道,本课题旨在探讨癌基因DEK是否与AP22促进HER2过量表达导致乳腺癌病变。

定量RT2PCR,扩增产物行115%琼脂糖凝胶电泳;其余细胞用RIPA缓冲液裂解,离心收集上清,进行蛋白质印迹;通过凝胶分析系统检测目的条带和内参照的灰度比值,统计分析目的基因和蛋白的表达变化。

115　统计学分析

1　材料与方法

111　材料

α为Weigell教授惠赠,质粒pCMV2HA2hAP22乳腺癌细胞系MDA2MB2453为本室保存。Trizol和Lipotectamine转染试剂(Invitrogen公司);HA抗体,

实验数据以均数±标准差(—x±s)表示,SPSS1310软件分析,采用t检验。

α抗体(H2DEK抗体(C217),AP2279),HER22抗体(anti2neu),DEKsiRNA(sc2αsiRNA38253),AP22(sc2105074),半定量RT2PCR引物(SantaCruz公

2　结果

211　HER2阴性和阳性乳腺癌组织标本中HER2

司);二抗和ECL试剂盒(Pierce公司)。冰冻HER22阳性和阴性乳腺癌组织标本各两例取自广州

α蛋白水平蛋白、DEK蛋白和AP22

α蛋白和HER2阴性标本中,HER2蛋白、AP22DEK蛋白水平显著低于HER22阳性标本中的对应

军区总医院病理科。112　肿瘤组织标本检测

蛋白(P<0101)(图1,表1)。

标本溶解后加入溶解缓冲液(50mmol/LTris2HClpH714,150mmol/LNaCl,1%NP240,011%SDS),用玻璃匀浆器匀浆,直至充解;14000×g离心5min,取上清,加入SDS2PAGE蛋白

上样缓冲液悬浮沉淀,100℃加热5min,离心,取上清行10%SDS2PAGE和Westernblot;一抗分别为α抗体及HER2DEK抗体、AP222抗体,二抗为辣根过氧化物酶标的相应二抗,ECL试剂盒显色。113　免疫共沉淀

图1　HER22阳性(2、4)和阴性(1、3)乳腺癌组织

α蛋白水平　　中的HER2、DEK及AP22

αproteinFig1　LevelofHER2,DEKandAP22

　　　inHER22positive(2,4)andnegative(1,3)　　　breastcancertissue

用Lipofectmine2000试剂转染pCMV2HA2hAP2α质粒至MDA22MB2453细胞,48h后离心收集细胞,PBS洗涤,RIPA缓冲液裂解,离心收集上清,一α,一半加入IgG抗体作半加入HA抗体沉淀AP22阴性对照,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物1h;离心收集上清,加入40μLRIPA缓冲液预平衡的ProteinA琼脂糖,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物2h;离心

α在乳腺癌细212　免疫共沉淀证实DEK和AP22胞内的相互作用

α和用DEK抗体能检测到DEK,表明AP22DEK结合而共沉淀;作为对照,用IgG抗体沉淀转

染AP22α的细胞裂解物不能共免疫沉淀AP22α和

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表1　HER22阳性(2、4)和阴性(1、3)乳腺癌组织标本

α蛋白水平的比较　　中的HER2、DEK及AP22

Table1　ComparisonofthelevelofHER2,DEKand

αproteininHER2　　　　AP222positive(2,4)

　　　　andnegative(1,3)breastcancertissue

—

　　　　(x±s,n=5)

group1234

HER2/actin0109±01070135±011330107±01050129±01093

DEK/actin0111±01090149±011130113±01050151±01103

α/actinAP22

0113±01100140±011030112±01050139±01093

P<0101comparedwithHER22negativebreastcancertissue

αsiRNA协同抑制乳腺癌图3　DEKsiRNA和AP22

　　细胞中HER2的蛋白水平

αinMDA2Fig3　DepletionofDEKandAP22MB2453

　　　cellbysiRNAcooperativelyrepressedHER2　　　expressionatproteinlevelsα和DEK在乳腺癌细胞DEK(图2),从而证实AP22内的特异结合。

αsiRNA协同抑制乳腺214　DEKsiRNA和AP22癌细胞中HER2mRNA水平

αsiRNA组HER2mRNA水DEKsiRNA+AP22平显著低于其他两组(图4,表3),各组均显著低于对照组(P<0101)。

α在乳腺癌细胞内的相互作用图2　DEK和AP22

αinMDA2Fig2　DEKinteractswithAP22MB2453

　　　mammarycancercells

αsiRNA对HER2213　DEKsiRNA或(和)AP22蛋白表达的影响

MDA2MB2453细胞分别转染DEKsiRNA和

αsiRNA协同抑制乳腺癌图4　DEKsiRNA和AP22

　　细胞中HER2mRNA水平

αinMDA2Fig4　DepletionofDEKandAP22MB2453

　　　cellbysiRNAcooperativelyrepressedHER2

—

　　　expressionatthemRNAlevel(x±s,n=5)

αsiRNA后,HER2蛋白水平下降,而同时转染AP22αsiRNA后,HER2蛋白水平较DEKsiRNA和AP22对照组下降更显著(P<0101)(图3,表2)。

αsiRNA抑制表2　DEKsiRNA或(和)AP22

　　HER2蛋白的表达

αsiRNAdownre2Table2　DEKsiRNAor/andAP22

—

　　　　gulatingHER2proteinexpression(x±s,n=5)

αsiRNA抑制表3　DEKsiRNA或(和)AP22

　　HER2mRNA的表达

αsiRNAdownre2Table3　DEKsiRNAor/andAP22

—

　　　　gulatingHER2mRNAexpression(x±s,n=5)

group　　

controlsiRNA

DEKsiRNA

HER2/GAPDH　　1159±01570167±011930121±011130106±01033

αsiRNAAP22

αsiRNADEKsiRNA+AP22

group1234

β2actinHER2/

0169±01170121±010930110±010530106±01033

DEK/β2actin0185±01290113±010530181±01160109±01053

α/β2actinAP22

2163±01392181±01570112±010530107±01033

P<0101comparedwithcontrolsiRNAgroup

3　讨论

α在HER2癌基因过量表达的乳腺癌变中AP22的作用已经得到证实,近来相继发现一些蛋白与α结合并促进AP2α的转录活性,如DEK、AP222

[8]

αsiRNA41DEKsiRNA+11controlsiRNA;21DEKsiRNA31AP22αsiRNAAP22

P<0101comparedwithcontrolsiRNAgroup

178

positivecofactor4

[9]

基础医学与临床　　Basic&ClinicalMedicine

、YinYang1

[10]

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和Ku70

[11]

等,但达乳腺癌细胞系内具有相互作用,并通过RNAi技α协同增强HER2基因术进一步阐明DEK和AP22表达,很好地反映了乳腺癌组织标本的病理特征。α的转录本研究首次证明了DEK是一类新的AP22α促进HER2的过量表达和共激活物,并协同AP22乳腺癌变,提示DEK对HER2基因的表达具有作用,可能是HER2过量表达乳腺癌的治疗靶点,为HER2高表达乳腺癌的研究和防治提供了重要依

是这些蛋白是否存在于乳腺癌细胞中,是否参与α活性及HER2基因表达的未见报道。在AP22α的相互作本课题中,我们围绕癌基因DEK和AP22用,以乳腺癌组织标本和乳腺癌细胞系为模型,对α及HER2之间的相互关系进行了研DEK和AP22究:用Westernblot检测发现,乳腺癌组织中DEK、α和HER2的蛋白水平之间存在一定的正相关AP22α在HER2高表性,免疫共沉淀证实了DEK和AP22

据。

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