漳州师范学院毕业论文（设计）
开 题 报 告
题 目：大西洋深海热液口嗜热菌的
金属耐受性培养
姓 名： 陈楠 学 号： 081301214 系 别： 生物科学与技术系 专 业： 生物科学 年 级： 2008级 指导教师： 胡俊西
2012年05月20日
一、 选题依据（含研究的目的和意义等） 1.1海热液喷口细菌的研究现状 近年来深海热液喷口生物群落的研究取得了大量的成果。通过调查发现，除温度外，环境化学参数、地理位置、喷口类型、热液活动周期、生物可利用率等因素都对深海热液喷口生物群落分布产生影响。随着实验室热液微生物的分离、培养成功，一些新的属种及其特殊的生理特征被发现。分子生物学技术的发展，使得对于深海热液生物基因测序、基因功能的研究和表达，功能基因对微生物生理功能的作用，动物与微生物之间的共生关系，生物对极端环境的适应机制等问题的研究都能够进行。对于目前不能进行实验室分离培养的微生物，通过基因组分析，也能够了解其群落结构。不同的深海热液啧17，其病毒的类型、分布、丰度以及病毒对热液生态系统的影响是不同的。通过这些研究，科学家探讨了热液喷口环境中生物群落的能量合成与代谢途径的相关理论，并提出了生命有可能起源于热液喷17：7环境的假说。 海洋微生物种类包括几乎所有的微生物类型，这些微生物因生存在海洋高盐、高压、低温、低营养和无光照等这种极端环境条件下而具有特殊的生理性状和遗传背景，具有许多特殊功能，如耐盐性、耐低温、耐高温、耐高压和高渗透性、固氮、还原、抗重金属等，现在对深海重金属抗性细菌的筛选研究多集中在热液口，而对其它深海环境中的重金属抗性微生物研究较少。本文从太平洋深海多金属结核区进行了重金属抗性菌筛选和分离鉴定，并对其对重金属的拭性机制或解毒机制开展了初步的研究。 1.2本实验的科学意义 首先，在海洋特别是大洋的深海和海底沉积物等极端环境中，其中存 活的微生物具有很多适应特殊环境的性质。它们参与了碳等元素的物质和能量循 环，是海洋生态系统的最重要组成部分。虽然微生物可能只占海洋总生物量的 10．20％，但相对于其他海洋生物它们拥有更为特殊的代谢功能和更高的生物化 学潜能。 其次，深海多金属结核区的铁锰结核是各种微生物群的独特栖息场所，细菌 的活动影响了间隙水和海底沉积物的成分。而铁锰结核形成的生长机理，存在三 种假说：一是自生化学沉积说，认为海底的PH值增高时，氢氧化铁会围绕一个 核心沉淀，这种沉淀物可吸附锰离子并产生催化作用，促使二氧化锰小断生成。 二是生物成因说，它的理论根据是，用扫描电子显微镜观察锰结核的表面和内部 细微构造时，发现结核表面有很多由底栖微生物形成的空管和微窟窿，当其形成 管子时，摄取了大量的微结核于壳内。三是火山活动说，认为火山爆发喷发出大 量气体，伴随着锰、铁、铜及其他微量金属，这些金属进入海水中后，沉淀出铁 的含水氧化物，使锰和其他金属经过氧化富集，沉淀，形成锰结核。 比较可信的理论是，锰结核由海面浮游生物在新陈代谢活动中聚集了海水中 的金属而成，因为浮游生物带几乎与锰结核分布区相吻合。专家们相信，一些微 生物能够从海水中提取金属，并且将这些金属组合成食物链，食物链被食用后， 排泄物便掉到海底，经常包围住珊瑚虫、玄武岩等外界物质，于是就形成结核石， 并逐渐生长。 根据深海多金属结核区的环境特点(富含重金属，微生物可能具有重金属积 累能力)以及深海细菌的独特性，筛选重金属抗性菌、研究重金属抗性与积累机 制具有极大的意义。 现在对于深海抗性菌的研究多集中于热液口，对于多金属结核区重金属抗性菌以及细菌对重金属抗性机制的研究鲜有报道，本实验在此方面做了大量工作， 填补了空白，对于海洋重金属抗性细菌的研究取得了一些成果，为深入研究与开 发提供了丰富的素材。 随着采矿业的发展和重金属在工农业等诸多领域的应用，排放到环境 中的含重金属离子的废水无论是从数量上还是种类上都大大的增加了。重金属是 对生态环境危害极大的一类污染物，它们进入环境后不能被生物降解而只能发生 各种形态问的相互转化和分散、富集过程(即迁移)，可被生物富集，通过食物链 进入人体，破坏生物体正常的生理代谢活动，危害人体健康。铬作为第二大重金 属污染，在地下水中含量在O．008．173uM，在土壤和海底沉积物中为98riM到 76mM[441，由于Cr(VI)是可溶的，它的流动性使其污染源很难查出，容易污染饮 用水。 许多重金属作为微量元素时对细胞来说是必须的，但往往是浓度变高就使它们具有了毒性。这是微生物具有对重金属的抗性的原因之一，在此基础上，某些微生物不仅仅自身能够抗高浓度的重金属，而且通过某些机制可以降低环境中的有毒重金属的浓度。如微生物可以把高毒的Cr(VI)还原为低毒的Cr(III)，降低环境毒性。因此筛选高效Cr(VI)还原菌株以及对Cr(VI)还原机制的研究，具有极大的意义，将为铬污染的环境治理打下基础。 参考文献： [1]丁玲1,2,李富超1，秦松1 .极端微生物的研究进展[J].海洋科学,2009,33(3). [2]杨波，陈新华.厦门地区近海温泉嗜热菌的分离、鉴定[J].海 峡,2007，26（1）. [3]周瑞平1,陈云宗1，唐代云1，王涛 2,游玲.大曲中一株嗜热细菌的分离与鉴定[J].酿酒科技,2010,1. [4]胡欣洁，邓斌，胡承.微生物α-淀粉酶的研究进展[J].中国仿伪，2005. [5]刘爱民1,2,黄为一2，极端酶的研究*[J].微生物学杂志,2004,24(6) 二 研究的内容及目标 2.1 研究的内容 本实验通过不同Cu2+、、、Ni2+、Cd2+的培养基平板划线法，筛选大西洋热液喷口中取得的微生物，得到具有较高耐Cu、Ni、Cd特性的微生物。 2.2 研究目标 一方面：通过本次实验，筛选大西洋热液喷口中取得的微生物，得到具有较高耐Cu、Ni、Cd特性的微生物，并对其结果分析，得到菌的金属的耐受性，为抗性金属的培养提供了合理的理论依据和实验材料。 另一方面：通过实验研究，可以进一步掌握分子生物操作，锻炼耐心细心、精准的研究精神，提高自学及实验能力。 三、研究方案及可行性分析（包括主要研究方法和手段，已有的主要设备、软件、资料等说明） 3.1 研究的方案 通过本次实验，用平板划线法筛选出嗜热菌的耐受菌。并从菌种质粒DNA的提取和菌株质粒DNA浓度和纯度的测定其具体步骤如下： 3.1.1菌种初筛（已做） 嗜热菌(L-216E培养基的菌株) 3.1.2培养观察菌落 将L-216E培养基的菌株放在PGX多段光照培养箱，设置28℃恒温培养4d，可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面,观察菌落的形态结构等。 3.1.3纯化菌种 接种，从初筛保存的纯种单菌落中沾取少量菌样，在70ml LB培养基里培养， 25~28℃，150 r/min摇床培养48 h直到测菌液在紫外分光光度计600mm时，其OD值为大于1时（以无菌水为样液），方可进行嗜热菌质粒DNA的提取。 3.1.4菌株质粒DNA的提取 实验前准备：使用前，将RNase A全部加入Solution I中并于4度保存。用无水乙醇稀释DNA Wash Buffer，并于室温保存：D6942-00, D6943-00 : 加入8ml无水乙醇；D6942-01,D6943-01: 加入80ml无水乙醇；D6842-02,D6943-02: 每瓶中加入80ml无水乙醇。 离心操作方案： 取10~15ml 的菌液，室温下10,000xg离心1min收集细菌。 倒弃培养液，加入500ul Solution I/RNaseA混合液，漩涡震荡使细菌完全悬浮。 往重悬混合液中加入500ul SolutionII,轻轻颠倒混匀4-6次，此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5min。 加入700ul SolutionIII，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。 室温下，≥12,000离心10min。 转移上清液至套有2ml收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下，10,000xg离心1min，倒去收集管中的滤液。 把柱子重新装回收集管，加入500ul HB Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。 把柱子重新装回收集管，加入700ul DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。 把柱子重新装回收集管，12,000xg离心空柱2min以甩干柱子基质。把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入80-100ul Elution Buffer到柱子基质中，静置1-2min，12,000xg离心1min洗脱出DNA。 加入20-30ul的TE缓冲液中，存放在4℃冰箱中【4】。 3.1.5菌株质粒DNA浓度和纯度的测定 以1：20或更高的比例将样品DNA溶液在TE(H2O)中稀释；用TE(H2O)在紫外分光光度计波长230、260、280nm处做空白校正；将DNA稀释溶液装入比色皿，读取上述三个波长下的光密度；记录光密度数据，通过计算0D 260/0D280值确定DNA的浓度和纯度[5]。 3.1.6菌种的抗性培养 准备：将培养基加热融化，金属试剂，酒精灯，灭菌过的培养皿，接种环等放入无菌操作室，开紫外灯15min。 操作:将培养基内分别加入金属试剂0.25M K2Cr2O7 ，1M CoCl2,1M MnCl2制备5m mol/L ,6 m mol/L,7 m mol/L,8 m mol/L,9 m mol/L,10 m mol/L，随后倒入培养皿，制成平板。 划线：凝固后，用接种环取相应的菌种划到相应的做好标记的培养皿中。 培养：划好平板后放在PGX多段光照培养箱，设置28℃恒温培养，观察菌落是否生成. 3.1.7菌种的保存 将已分纯的待存菌接种于LB液体培养基，37℃培养18～24h，按5份LB液体培养基、2份甘油－生理盐水保存液的比例分装于灭菌的1.5ml离心管中，贴上标签，置－20℃冰箱保存。用于下届学生使用。 3.2 实验材料及仪器 实验材料：保存L-2161培养基的嗜热菌菌株。 实验仪器：PGX多段光照培养箱；双人单面净化工作台；微波炉；立式压力蒸汽灭菌器；电子天平；震荡培养箱；台式高速离心机；冰箱 ；显微镜 ；紫外可见光分光光度计；移液等 3.3 可行性分析 (1) 分子生物学操作技术是一项较为精细的技术，作为一名生物科学专业的师范生必须在课堂教学和实验课程中已基本掌握该技术，加上本人曾在老师的指导下，参与过与分子研究相关的科研项目，掌握熟练的操作技巧，在实验过程中参照以往经验，根据已有资料的分析，完成这项研究实验的可行性很高； (2)本人指导老师对嗜热细菌的研究时间较长，具有丰富的经验和原料来源，因此原材料的取得也比较容易。 四、研究进度计划 第一阶段：查阅与实验相关的资料，弄清实验原理，整理实验方案； 第二阶段：实验前准备工作，准备好实验材料及仪器； 第三阶段：动手操作实验，记录实验数据； 第四阶段：整理实验数据，分析实验结果； 第五阶段：写出实验相关论文。 五、指导教师意见 指导教师签名： 年 月 日 六、教研室意见 教研室主任签名： 年 月 日
