三种鉴别诊断PRRSV美洲型经典毒株和变异株的方法比较

陈仕龙;郑敏;陈少莺;江斌;林锋强;朱小丽;王劭;程晓霞;黄梅清;李兆龙 【摘 要】Three diagnostic method including the virus isolation and identification （VI）, direct immunofluorescence assay （DFA） and reverse transcriptase polymerase chain reaction （RT-PCR） were employed to detect 99 specimens , parallelly. The results showed that the coincidence between DFA and VI, DFA and RT-PCR were 92.5% and 92.2%, respectively. RT-PCR was the highest sensitivity and specificity, which could be used as the first choice for laboratory differential diagnosis. DFA was high specificity and fast, especially useful for PRRS＇s clinic detecting. The virus isolation＇s procedure was complicated, consumed long time, had a low sensitivity and positive separation needed other methods to identification. Therefore virus isolation was not a suitable test for distinguish detection.%我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）包括美洲型经典毒株和变异株。本研究应用RT—PCR、直接免疫荧光（ direct immunofluorescence asay, DFA ）及病毒分离3种检测方法对99份不同类型的猪繁殖与呼吸综合征临床疑似病料和人工感染病料进行检测。结果显示，RT—PCR检测试剂盒敏感性最高，DFA鉴别诊断试剂盒次之，病毒分离最差。DFA与病毒分离、RT—PCR的总符合率分别为92％和85．5％。RT—PCR灵敏性高，可作为PRRSV鉴别诊断的首选方法；DFA鉴别诊断法所需时间较短、特异性好，但需要一定的操作经验；病毒分离敏感性低、操作繁琐，阳性分离需要其它方法验证，不适合于PRRSV的鉴别诊断。

【期刊名称】《中国动物传染病学报》 【年(卷),期】2011(019)004 【总页数】5页(P71-75)

【关键词】猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型经典毒株;猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株;RT-PCR;DFA免疫荧光诊断试剂盒;病毒分离

【作 者】陈仕龙;郑敏;陈少莺;江斌;林锋强;朱小丽;王劭;程晓霞;黄梅清;李兆龙 【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福州350013 【正文语种】中 文 【中图分类】S852.659.6

猪繁殖与呼吸综合征（俗称猪蓝耳病）(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的，以成年母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要症状的猪传染病。PRRSV分为美洲型和欧洲型两个基因型[1,2]。1996年以来，中国流行的是美洲型PRRSV[3]。2006年以来流行于中国的猪高热病，是由美洲型PRRSV变异株引起的一种急性高致死性疫病，对各日龄猪均敏感，主要表现为猪高热(41℃以上)、高发病率、高死亡率、低治愈率。

美洲型传统毒株和变异株鉴别诊断方法有RTPCR、荧光定量PCR及免疫荧光等方法。本文在建立间接免疫荧光（indirect fluorescent antibody test,IFA）鉴别诊断方法的基础上[4]，研制出免疫荧光鉴别诊断试剂盒。为了验证该免疫荧光诊断试剂盒的准确性、敏感性和实用性，本研究对临床送检的疑似病例及人工感染病料进行了RT-PCR、直接免疫荧光检测及病毒分离3种方法的检测，以期对各种诊断方法进行综合评价，旨在筛选出能适合各类型PRRS诊断的实用方法。 1 材料与方法

1.1 病料采集及处理 来源于福建省福清、长乐、南平等地区疑似PRRS病例87份。无菌采集病死猪的肺脏、肺门淋巴结、脾脏、肾脏等组织和，剪碎研磨，以Hank’s液制成1:5匀浆，加双抗各1000 U，4℃过夜，冻融3次，1600×g离心20 min，取上清液用于病毒分离及RT-PCR检测。采集疑似PRRS病料的肺脏和肺门淋巴结，制备冰冻切片，用于DFA检测。

1.2 试剂及毒株 美洲型PRRSV传统毒株和变异株免疫荧光鉴别诊断试剂盒由本试验室制备，主要包括只能识别传统美洲型PRRSV 的荧光单抗A61及既能识别传统美洲型又能识别变异型PRRSV的荧光单抗C65；RT-PCR鉴别诊断试剂盒购自北京博德安晟商贸发展有限公司；传统美洲型毒株PRRSV-FZ及美洲型变异株

PRRSV-FJ0605由本实验室分离、鉴定、保存。

1.3 病料的直接免疫荧光检测(direct immunof l uorescence assay, DFA)检测 取病料的冰冻切片，按本试验室制备免疫荧光鉴别诊断试剂盒的方法进行DFA检测，即切片加入1%BSA-PBS稀释的A61/C65荧光单抗，37℃作用30 min后，用PBS充分洗涤，甘油-PBS封片后镜检观察。若A61、C65荧光单抗加样组都为阳性反应，则为美洲型PRRSV传统毒株感染；若仅有C65荧光单抗组为阳性反应，则为美洲型PRRSV变异株感染；若A61荧光单抗为阳性反应，而C65荧光单抗为阴性，则结果无效。

1.4 病料的RT-PCR检测 取病料匀浆按常规方法提取病毒核酸，按照试剂盒的说明进行RT-PCR试验，扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳，出现511 bp特异性条带的为传统美洲型PRRSV毒株感染，扩增出421 bp特异性条带的为美洲型PRRSV变异株感染，并将扩增产物送大连宝生物工程有限公司测序验证。 1.5 病毒分离（virus isolation, VI） 取 DFA及RT-PCR检测均为变异型PRRS的阳性病料5份，DFA及RT-PCR检测均为传统型PRRS的阳性病料5份，DFA及RT-PCR检测均为阴性的病料5份在Marc145细胞单层中进行病毒分离。当出现细胞病变或盲传3代时用RT-PCR鉴别诊断试剂盒进行验证。

1.6 PRRSV人工感染猪及病料的采集 选取28日龄、PRRSV抗体阴性健康仔猪12头，随机分成3组，4头/组。第一组用美洲型变异株PRRSV-FJ0605第7代病毒培养物（104.0TCID50/mL）经滴鼻、肌注途径接种，剂量为2 mL/头；第二组用传统美洲株PRRSV-FZ（104.5TCID50/mL）经滴鼻、肌注途径接种，剂量为2 mL/头；第三组为未攻毒健康对照猪。三组隔离饲养，每日观察临床反应、测定直肠体温。于病毒接种后d 8每组剖杀2头，d 14剖杀2头，采集肺脏、肺门淋巴结等脏器，制作冰冻切片和组织匀浆，用于病毒分离、免疫荧光检测、RT-PCR检测。

2 结果与讨论

2.1 疑似病料的DFA检测 采用实验室试制的PRRS DFA鉴别诊断试剂盒对临床疑似PRRS疫情的87份病料进行检测，PRRS总阳性数37份，阳性率为43%；其中变异型PRRS有24份，占PRRS阳性率的65%，传统美洲型PRRS 13份，占PRRS阳性率的35%；50份样品检测为阴性。淋巴节及肺脏切片的阳性荧光反应见图1 A-D。

图1 淋巴节及肺脏切片的阳性荧光反应（200×）Fig.1 The positive reaction of Lymph node and lung by DFA (200×)A:正常猪淋巴结；B: A61/C65荧光单抗与PRRSV传统毒株感染后猪淋巴结的阳性反应；C: A61荧光单抗不能识别PRRSV变异株感染的猪淋巴结，呈阴性反应；D: C65荧光单抗与PRRSV变异株感染后淋巴结的阳性反应；E:正常猪肺脏；F:A61/C65荧光单抗与PRRSV传统毒株感染后猪肺脏的阳性反应；G: A61荧光单抗不能识别PRRSV变异株感染后的肺脏，呈阴性反应；H: C65荧光单抗与PRRSV变异株感染后肺脏的阳性反应A: Negative control of normal Lymph nodes; B: Lymph nodes of classical PRRSV infection could be recognized by A61 or C65 fluorescent antibody; C: Lymph nodes of variant PRRSV infection could not be recognized by A61 fluorescent antibody; D: Lymph nodes of variant PRRSV infection could be recognized by C65 fluorescent antibody; E: Negative control of normal lung；F: Lungs of classical PRRSV infection could be recognized by A61 or C65 fluorescent antibody; G: Lungs of variant PRRSV infection could not be recognized by A61 fluorescent antibody; H: Lungs of variant PRRSV infection could be recognized by C65 fluorescent antibody

2.2 疑似病料的RT-PCR检测及与DFA的符合率比较 采用RT-PCR鉴别诊断试剂盒对87份疑似病料进行平行检测，结果PRRSV总阳性数为39份，阳性率为

45%；其中变异型PRRSV有24份，占PRRS阳性率的62%，传统美洲型PRRS 15份，占PRRS阳性率的38%；48份样品检测为阴性。经过对扩增产物的测序验证，凡是扩增出421bp特异性条带的毒株在Nsp2区域有两处基因，共缺失30个氨基酸，符合美洲型PRRSV变异株的特征；凡是扩增出511 bp片段的毒株，在Nsp2区域不存在缺失，符合传统PRRSV毒株的特征。DFA与RTPCR检测变异性PRRS的符合率为100%，DFA与RT-PCR检测传统型PRRS的阳性符合率为87%（13/15），DFA与RT-PCR的阴性符合率为96%（48/50），DFA与RT-PCR检测临床疑似病料的总符合率为94.3%。

2.3 临床确诊病料的病毒分离 结果5份变异型PRRS病料病毒分离均为阳性；5份传统型PRRS病料，只有4份病毒分离为阳性；5份PRRS阴性病料病毒分离都为阴性。

2.4 PRRSV人工感染猪的临床表现 PRRSVFJ0605接种后2～3d，仔猪开始陆续发热，直肠温度达40.5℃～42.5℃，持续高热9～12 d。病程前期临床表现为：食欲不振、精神沉郁、眼睑水肿、皮肤充血、严重的呼吸困难，病猪濒死。PRRSV-FZ组感染组病情较轻，体温略升高（39.3℃～40.6℃），仔猪咳嗽、采食减少，未见死亡；阴性对照猪在观察期间未见异常。

图2 传统美洲型和变异型PRRSV毒株的RT-PCR鉴定图Fig.2 PRRSV’s identif i cation by RT-PCR differential diagnosis kit1、9：阴性猪肺脏匀浆；2：美洲型变异株PRRSV-FJ0605的阳性对照；3～5：疑似病料的肺脏匀浆；6：DNA 分子量标准(DL2000)；7: 传统美洲型毒株PRRSV-FZ的阳性对照；8：疑似病料的肺脏匀浆1,9: Negative control; 2: Variant PRRSV strain FJ0605; 3-5:Pigs’lungs of suspected diseased ; 6: DNA Marker(DL2000);7: Classical strain PRRSV-FZ; 8: Pigs’lungs of suspected diseased

2.5 人工感染猪DFA、RT-PCR及VI三种方法的平行检测 分别采集每头攻毒猪的

肺脏、淋巴结、肾脏等组织，制成匀浆在Marc145细胞中进行病毒分离，待出现细胞病变时，用PRRSV单抗进行免疫荧光验证；取攻毒猪内脏匀浆，提取核酸，按照PRRSV RT-PCR鉴别诊断试剂盒进行检测；取攻毒猪肺脏及肺门淋巴结，制备冰冻切片，用于DFA检测。结果，变异株攻毒组4头猪病毒分离、DFA和RT-PCR检测均为阳性。传统美洲株攻毒组4头猪RT-PCR均为阳性，而VI及DFA检测均是3头阳性。

2.6 人工感染和确诊病料DFA检测与VI及RTPCR检测的符合率比较 本研究共对12份人工感染病料及15份临床确诊病料进行了DFA与VI及RT-PCR的符合率统计，见表1。变异型PRRS 9份，病毒分离、RT-PCR和DFA检测均为阳性。传统型PRRS 9份，病毒分离阳性数7份，阴性2份；DFA检测阳性数8份，阴性1份；RT-PCR检测都是阳性。9份阴性病料三种方法检测都是阴性。DFA与VI的阳性符合率为94%（16/17），阴性符合率为91%（10/11），DFA与VI的总符合率为92.5%。DFA与RT-PCR之间的阳性符合率为94%（17/18），阴性符合率为90%（9/10），DFA与RT-PCR之间的总符合率为92.2%。 表1 三种方法对12份人工感染和15份确诊病料检测结果的比较Table 1 The comparison of three diagnostic methods for detecting classical PRRSV and variant PRRSVDFA RT-PCR V I阳性 阴性 阳性 阴性 阳性 阴性9份变异型PRRS 9 0 9 0 9 0 9份传统型PRRS 8 1 9 0 7 2 9份PRRS阴性病料 0 9 0 9 0 9病料Specimens

2.7 本研究用自己研制PRRS鉴别诊断DFA试剂盒、RT-PCR鉴别诊断试剂盒及VI 3种诊断方法对临床疑似病例及人工感染病料进行检测，并进行符合率比较，以期为我国正流行的传统美洲型PRRS和变异型PRRS的鉴别诊断提供理论依据。结果，RTPCR敏感性最强，DFA次之，VI最差。DFA免疫荧光诊断法与病毒分离的符合率达92.5%，与商品化的RT-PCR诊断试剂盒之间的符合率为92.2%。

说明我们研制的DFA诊断试剂盒试验结果可靠，敏感性强，可用于临床各类型PRRS的确诊。

本研究应用3种方法对疑似病例及人工感染病料检测发现，变异型PRRSV毒株比传统PRRSV毒株更易病毒分离成功。我们对人工感染病例各器官检测也发现，变异型PRRSV广泛分布于各个器官，而传统美洲型PRRSV毒株则主要分布在肺脏、淋巴结等器官。这在一定程度上解释了PRRSV变异株的致病性、传染性高于传统美洲型PRRS的原因。

要从根本上预防和消灭PRRSV，研制快速、简便且适于基层推广应用的诊断试剂具有重要的社会意义。传统PRRSV和变异型PRRSV鉴别诊断的RT-PCR 试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒，具有敏感性强、检测时间较短(5～10 h 得出结果) 等优点，但试验成本较高，操作繁琐、需要较多的仪器设备，不适合兽医临床和基层对PRRS的快速诊断，且核酸样品容易交叉污染，出现假阴性，造成阴性检查出率过高的现象。病毒分离是诊断病毒性疾病的金标准，特异性强，常用于新诊断试剂的评价；但耗时长，敏感性不高，成本和技术要求高，且阳性分离物还需要借助其它方法进行验证，一般适用于技术和设备较好的科研机构的回顾性诊断[5]。本项目组研制的鉴别传统美洲型PRRSV和变异型PRRSV的DFA试剂盒简便、快速、特异性强、成本低，适用于各类PRRS疫情的快速诊断、鉴别、流行病学调查等，特别是对采集不及时或死亡时间过长等样品的检测具有较强的优势，弥补了RT-PCR、VI等检测方法过程复杂，费时费力的缺陷。但是该DFA试剂盒需配备荧光显微镜、冰冻切片机，操作人员要有一定的经验，样品处理方法为冰冻切片，不适宜做活体检测，其进一步的推广应用。以后应加强该荧光诊断试剂盒在活体或死后组织触片的应用研究，使建立的DFA诊断方法更简单和实用。 参考文献

【相关文献】

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[2] 黄梅清, 车勇良, 陈少莺, 等.猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型FJ0602 株的分离及其ORF7 的序列分析[J].中国预防兽医学报, 2008, 30(3): 174-178.

[3]郭宝清, 陈章水, 刘文兴, 等.从疑似PRRS 流产胎儿分离PRRSV 的研究[J].中国畜禽传染病, 1996, 18(2): 124.

[4]陈仕龙, 黄梅清, 林天龙, 等.高致病性猪生殖与呼吸综合征病毒间接免疫荧光鉴别方法的建立[J].中国兽医科学, 2009, 39(1): 41-44.

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