一种菌株、其制备方法及应用,以及该菌株的发酵方法[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 105483033 A (43)申请公布日 2016.04.13

(21)申请号 201511000505.9(22)申请日 2015.12.25

(71)申请人天津大学

地址300072 天津市南开区卫津路92号20

楼东配109(72)发明人元英进 刘高冈 李炳志(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限

公司 11227

代理人赵青朵(51)Int.Cl.

C12N 1/19(2006.01)C12N 15/81(2006.01)C12N 15/31(2006.01)C12P 7/06(2006.01)C12R 1/865(2006.01)

权利要求书1页 说明书11页 附图6页

(54)发明名称

一种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法(57)摘要

本发明涉及微生物领域，特别涉及一种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法。本发明在重组木糖利用酿酒酵母菌株中用多拷贝游离型质粒pRS425K以启动子过表达酿酒酵母内源基因ZWF1，得到能够提高木糖、葡萄糖同步共利用中木糖比例的重组酿酒酵母菌株。本发明分子操作简单，无需通过长期的进化过程，就可以初步实现木糖、葡萄糖的同步共利用。

C N 1 0 5 4 8 3 0 3 3 ACN 105483033 A

权　利　要　求　书

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1.一种重组酿酒酵母菌株，其特征在于，过表达酿酒酵母内源基因ZWF1。2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，选用启动子将内源基因ZWF1通过表达载体在底盘菌株中过表达。

3.根据权利要求1或2所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述底盘菌株为重组酿酒酵母SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3；RPE1::TRP1)或重组酿酒酵母SyBE_Sc17002(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3)。

4.根据权利要求1至3任一项所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所用表达载体为游离型多拷贝质粒pRS425K。

5.根据权利要求1至4任一项所述的重组酿酒酵母菌株，其特征在于，所述启动子为酿酒酵母内源启动子TPI1p、TDH1p或TEF1p。

6.根据权利要求1至5任一项所述的重组酿酒酵母菌株在木糖、葡萄糖同步共利用过程中提高木糖、葡萄糖共同利用率中的应用。

7.根据权利要求1至5任一项所述的重组酿酒酵母菌株的制备方法，其特征在于，过表达酿酒酵母内源基因ZWF1。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，选用TPI1p、TDH1p或TEF1P启动子将内源基因ZWF1以游离型多拷贝质粒pRS425K在底盘菌株SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3；RPE1::TRP1)或重组酿酒酵母SyBE_Sc17002(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3)中过表达。

9.一种在木糖、葡萄糖同步共利用过程中提高木糖、葡萄糖共同利用率的发酵方法，其特征在于，包括采用如权利要求1至5任一项所述的重组酿酒酵母菌株在木糖、葡萄糖的混糖条件下发酵培养。

10.根据权利要求9所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为限氧培养。

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一种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法

技术领域

[0001]本发明涉及微生物领域，特别涉及一种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法。

背景技术

[0002]液体燃料方便运输和便于利用，已成为重要的工业和日常能量来源。其中，石油是目前全球使用最多的液体燃料，但是，石油资源不可再生且CO2和其他污染气体的排放会导致环境的恶化。发展可再生的清洁能源成为我国的能源发展战略的重中之重。乙醇作为可替代的清洁液体能源受到广泛的关注，传统生产乙醇的方法是以粮食为原料，采用酵母直接发酵的产生乙醇，但此种方法需要消耗大量的粮食，这与我国生物质能源发展坚持“不与人争粮不与粮争地”的原则相违背。农业废弃物逐渐进入人们的视线，如玉米秸秆，高粱秸秆，小麦秸秆等，农业废弃物也是碳水化合物，并且每年产量巨大，这些废弃物得不到有效利用便会被农民烧掉，不仅浪费能源而且污染环境。利用农业废弃物即木质纤维素经过预处理后经过酶解得到的葡萄糖和木糖可以被酵母菌所利用产生乙醇，采用这种方法既保护了环境，又能有效利用资源，得到清洁能源，是非常有意义的能源利用方式。[0003]但目前，制约木质纤维素发展的瓶颈是重组酵母对木糖的利用，经预处理后的木质纤维素水解物中有约30％为木糖，天然的酿酒酵母不能利用木糖，体内直接整合或者以质粒形式表达的木糖代谢途径的酿酒酵母如未经驯化则利用木糖的速度缓慢，而且明显存在葡萄糖阻遏问题，即培养基中如果存在葡萄糖，则葡萄糖会被优先利用，木糖几乎不被利用，只有葡萄糖耗尽后，木糖才开始被利用。这就大大延长了发酵周期，降低了纤维素乙醇的生产效率。因此，开发能够高效同步共利用木糖、葡萄糖的酿酒酵母菌株显得尤为重要。[0004]现有的构建木糖利用酿酒酵母的方法有：在酵母染色体上整合木糖还原酶-木糖醇脱氢酶(XR-XDH)途径或者木糖异构酶(XI)途径，再者，就是构建质粒形式的上述途径。[0005]在这些构建方法中，表达(XR-XDH)途径过程中由于XR及XDH两种酶辅因子偏好性不同，XR是NADPH依赖型，而XDH需要大量的NAD+，这就造成了酵母细胞内辅因子的不平衡，以致木糖醇大量积累，降低了木糖的利用率。而表达(XI)途径的菌株通常由于受到该酶活性的，利用木糖的速度相对缓慢。而且通过基因工程得到的木糖利用重组酵母菌株在发酵过程中往往会存在严重的葡萄糖阻遏现象，不能满足纤维素乙醇的工业化生产的要求。

发明内容

[0006]有鉴于此，本发明提供一种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法。本发明提供的一种提高木糖利用酿酒酵母木糖、葡萄糖同步共利用中木糖比例的方法，本发明的方法无需通过进化工程，分子操作简单，构建目的菌株所需时间较短，能够克服葡萄糖代谢阻遏，在混糖发酵时实现葡萄糖存在下木糖、葡萄糖消耗比例达到1/8。[0007]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

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本发明提供了一种重组酿酒酵母菌株，过表达酿酒酵母内源基因ZWF1。

[0009]在本发明的一些具体实施方案中，所述内源基因为酿酒酵母L2612内源[0010]基因ZWF1。

[0011]在本发明的一些具体实施方案中，所述重组酿酒酵母菌株选用启动子将内源基因ZWF1通过表达载体在底盘菌株中过表达。[0012]在本发明的一些具体实施方案中，所述重组酿酒酵母菌株所述底盘菌株为重组酿酒酵母SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3；RPE1::TRP1)或重组酿酒酵母SyBE_Sc17002(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3)。[0013]在本发明的一些具体实施方案中，所述重组酿酒酵母菌株所用表达载体为游离型多拷贝质粒pRS425K。

[0014]在本发明的一些具体实施方案中，所述重组酿酒酵母菌株所述启动子为酿酒酵母内源启动子TPI1p、TDH1p或TEF1p。

[0015]本发明还提供了所述的重组酿酒酵母菌株在木糖、葡萄糖同步共利用过程中提高木糖、葡萄糖共同利用率中的应用。

[0016]本发明还提供了所述的重组酿酒酵母菌株的制备方法，过表达酿酒酵母内源基因ZWF1。

[0017]在本发明的一些具体实施方案中，所述的重组酿酒酵母菌株的制备方法选用TPI1p、TDH1p或TEF1p启动子将内源基因ZWF1以游离型多拷贝质粒pRS425K在底盘菌株SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS，ura3；RPE1::TRP1)或重组酿酒酵母SyBE_Sc17002(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3)中过表达。[0018]本发明还提供了一种在木糖、葡萄糖同步共利用过程中提高木糖、葡萄糖共同利用率的发酵方法，包括采用所述的重组酿酒酵母菌株在木糖、葡萄糖的混糖条件下发酵培养。

[0019]在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵方法中发酵培养的条件为限氧培养。[0020]在本发明的一些具体实施方案中，所述发酵方法中发酵培养基为混糖YP(D+X)，培养条件为限氧培养，控制方法为发酵过程中在250ml细口锥形瓶瓶口塞上插有7号针头的5号橡胶塞。

[0021]培养方法：用接种环从生长于SC-Leu固体平板上的单菌落挑取一环接种于3ml SC-Leu液体培养基中，30℃，220rpm培养24～36h，此培养物为一级种子。[0022]一级种子培养结束后，转接于装有80ml SC-Leu液体培养基的250ml广口锥形瓶中，转接后OD600控制在0.1，30℃，220rpm培养14～18h，此培养物为二级种子。[0023]二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。接种具体方法为：测量二级种子培养物OD600值，按发酵培养接种浓度为OD600＝1计算接种量。用无菌的50ml离心管5000rpm离心8min(4℃)，弃上清，30ml无菌水洗涤1次，再次按上述条件离心，弃上清，用5ml发酵培养基将细胞冲洗到发酵用250ml 细口锥形瓶中。30℃，150rpm条件下进行发酵。发酵条件为限氧培养，控制方法为用插有7号针头的5号橡胶塞塞住发酵用250ml细口锥形瓶。[0024]培养基成分：

[0025]种子培养基SC-Leu(配方：酵母氮源6.7g/L，氨基酸粉末混合物2g/L，葡[0026]萄糖20g/L，再加入氨基酸母液(L-组氨酸盐酸盐，L-色氨酸，尿嘧啶)，

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调pH至6.5,115℃，15min灭菌)。表1 氨基酸粉末混合物配方

成分 甘氨酸 赖氨酸 甲硫氨酸

对氨基苯甲酸 苯丙氨酸 脯氨酸 丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸 缬氨酸

质量(g) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

成分 质量(g) 腺嘌呤 0.5 丙氨酸 2 精氨酸 2 天冬氨酸 2 天冬酰胺 2 半胱氨酸 2 谷氨酰胺 2 谷氨酸 2 异亮氨酸 2 肌醇 2

[0030]表2 氨基酸母液浓度

[0031]

发酵培养基：

[0033]1、酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L,葡萄糖80g/L,木糖20g/L，在SyBE_Sc17004中表达空载体pRS425k得到的对照菌株，以及过表达不同启动子控制下ZWF1的几株菌SyBE_Sc122001，SyBE_Sc122006，SyBE_Sc122009的发酵都是在这个培养基条件下的实施例。[0034]2、酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L,葡萄糖40g/L,木糖20g/L，在SyBE_Sc17002中表达空载体pRS425k得到的菌株SyBE_Sc122033，以及过表达不同启动子控制下ZWF1的几株菌SyBE_Sc122034，SyBE_Sc122035的发酵都是在这个培养基条件下的实施例。[0035]与现有技术相比，本发明在木糖利用重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS，ura3；RPE1::TRP1)中用酿酒酵母内源启动子TPI1p以表达载体游离型多拷贝质粒pRS425K过表达L2612内源基因ZWF1，得到能同步共利用木糖、葡萄糖的比例为1/8的菌株SyBE_Sc122001。该方法应用常用游离型多拷贝载体pRS425K在重组木糖利用酿酒酵母菌株中过表达内源基因ZWF1，能够实现在混糖发酵过程中提高木糖、葡萄糖同

无需经过长期的进化过程，是解决木糖步共利用过程中木糖的比例。本发明分子操作简单，

利用重组酿酒酵母中普遍存在的葡萄糖阻遏问题的一种尝试。[0036]结果表明，菌株SyBE_Sc122001经混糖限氧发酵培养后，木糖、葡萄糖同步共利用的比例约为1/8。

[0032]

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附图说明

[0037]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。[0038]图1示底盘菌株SyBE_Sc17004(L2612，delta::XYL1,XYL2,XYL3，ura3；RPE1::trp1)木糖代谢途径的构建；

[0039]图2示底盘菌株SyBE_Sc17004(L2612，delta::XYL1,XYL2,XYL3，ura3；RPE1::trp1)的RPE1基因的敲除；

[0040]图3示以启动子TPI1p过表达ZWF1质粒载体图谱；其中，启动子为TPI1p，终止子为PGK1t，所用表达质粒为游离型多拷贝质粒pRS425K；

[0041]图4示SyBE_Sc122001与对照株在YP(D80g/L+X20g/L)条件下发酵木糖、 葡萄糖消耗情况；示过表达ZWF1菌株SyBE_Sc122001与对照菌株(在SyBE_Sc17004中转入空载体质粒pRS425k)在80g/L葡萄糖和20g/L木糖的混糖条件下发酵结果；表示对照菌株葡萄糖随时间的累积消耗量；表示菌株SyBE_Sc122001葡萄糖随时间的累积消耗量；表示对照菌株木糖随时间的累积消耗量；表示菌株SyBE_Sc122001木糖随时间的累积消耗量；取24h样品点计算菌株木糖葡萄糖同步共利用的比例，对照菌株这一比例为：7.5246000240587/77.37617＝1/10.283，SyBE_Sc122001的这一比例为：9.31553/80.98729＝1/8.6938；

[0042]图5示SyBE_Sc122006与对照株在YP(D80g/L+X20g/L)条件下发酵木糖、葡萄糖消耗情况；示过表达ZWF1菌株SyBE_Sc122006与对照菌株(在SyBE_Sc17004中转入空载体质粒pRS425k)在80g/L葡萄糖和20g/L木糖的混糖条件下发酵结果；表示对照菌株葡萄糖随时间的累积消耗量；表示菌株SyBE_Sc122006葡萄糖随时间的累积消耗量；表示对照菌株木糖随时间的累积消耗量；表示菌株SyBE_Sc122006木糖随时间的累积消耗量；取24h样品点计算菌株木糖葡萄糖同步共利用的比例，对照菌株这一比例为：7.5246000240587/77.37617＝1/10.283，SyBE_Sc122006的这一比例为：9.770992/82.39735＝1/8.4328；

[0043]图6示SyBE_Sc122009与对照株在YP(D80g/L+X20g/L)条件下发酵木糖、葡萄糖消耗情况；示过表达ZWF1菌株SyBE_Sc122009与对照菌株(在SyBE_Sc17004中转入空载体质粒pRS425k)在80g/L葡萄糖和20g/L木糖的混糖条件下发酵结果；表示对照菌株葡萄糖随时间的累积消耗量；表示菌株SyBE_Sc122009萄糖随时间的累积消耗量；表示对照菌株木糖随时间的累积消耗量；表示菌株SyBE_Sc122009木糖随时间的累积消耗量；取24h样品点计算菌株木糖葡萄糖同步共利用的比例，对照菌株这一比例为：7.5246000240587/77.37617＝1/10.283，SyBE_Sc122009的这一比例为：9.603272/82.43997＝1/8.5846；

[0044]图7示SyBE_Sc122034与对照株SyBE_Sc122033在YP(葡萄糖40g/L+木糖20g/L)条件下发酵木糖、葡萄糖消耗情况；过表达ZWF1菌株SyBE_Sc122034与对照菌株SyBE_Sc122033在40g/L葡萄糖和20g/L木糖的混糖条件下发酵结果；图例中：表示对照菌株葡萄糖随时间的累积消耗量；表示菌株 SyBE_Sc122034葡萄糖随时间的累积消耗量；

表示对照菌株木糖随时间的累积消耗量；表示菌株SyBE_Sc122034木糖随时间的累

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积消耗量；取6h样品点计算菌株木糖葡萄糖同步共利用的比例，对照菌株SyBE_Sc122033这一比例为：0.4145/10.7936＝1/22.066，SyBE_Sc122034的这一比例为：2.378256/16.99553＝1/7.146；

[0045]图8示SyBE_Sc122035与对照株SyBE_Sc122033在YP(葡萄糖40g/L+木糖20g/L)条件下发酵木糖、葡萄糖消耗情况；示过表达ZWF1菌株SyBE_Sc122035与对照菌株SyBE_Sc122033在40g/L葡萄糖和20g/L木糖的混糖条件下发酵结果；图例中：表示对照菌株葡萄糖随时间的累积消耗量； 表示菌株SyBE_Sc122035葡萄糖随时间的累积消耗量；

表示对照菌株木糖随时间的累积消耗量；表示菌株SyBE_Sc122035木糖随时间的累积消耗量；取6h样品点计算菌株木糖葡萄糖同步共利用的比例，对照菌株SyBE_Sc122033这一比例为：0.4145/10.7936＝1/22.066，SyBE_Sc122035的这一比例为：1.52406/13.19278＝1/8.656；可见，在其他菌株中过表达内源基因ZWF1也能够提高葡萄糖、木糖同步共利用过程中木糖的比例。

具体实施方式

[0046]本发明公开了一种菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。[0047]本发明提供了使重组酿酒酵母同步共利用五、六碳糖的方法，包括以下步骤：[0048]在木糖利用重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3；RPE1::TRP1)中，用酿酒酵母内源启动子TPI1p以表达载体游离型多拷贝质粒pRS425K过表达L2612内源基因ZWF1，所得菌株SyBE_Sc122001在YP(D+X)培养基中限氧培养发酵，初始OD为1.0，发酵至 培养基中葡萄糖耗尽，能同步共利用木糖、葡萄糖的比例约为1/8。在SyBE_Sc17004转入空载体质粒pRS425K得到菌株为对照菌株(Control)。[0049]优选的，所用底盘菌株为SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3；RPE1::TRP1)。[0050]优选的，所述启动子为酿酒酵母内源启动子TPI1p。[0051]优选的，所述表达载体为游离型多拷贝质粒pRS425K。[0052]优选的，所述过表达的基因为酿酒酵母L2612内源ZWF1。[0053]优选的，所述初始发酵接种OD为1.0。[0054]优选的，所述发酵条件为限氧培养，控制方法为用插有7号针头的5号橡胶塞塞住发酵用250ml细口锥形瓶。[0055]与现有技术相比，本发明在木糖利用重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS，ura3；RPE1::TRP1)中用酿酒酵母内源启动子TPI1p以表达载体游离型多拷贝质粒pRS425K过表达L2612内源基因ZWF1，得到能同步共利用木糖、葡萄糖的比例为1/8的菌株SyBE_Sc122001。该方法应用常用游离型多拷贝载体pRS425K在重组木糖利用酿酒酵母菌株中过表达内源基因ZWF1，能够实现在混糖发酵过程中提高木糖、葡萄糖同步共利用过程中木糖的比例。本发明分子操作简单，无需经过长期的进化过程，是解决木糖

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利用重组酿酒酵母中普遍存在的葡萄糖阻遏问题的一种尝试。[0056]结果表明，菌株SyBE_Sc122001经混糖限氧发酵培养后，木糖、葡萄糖同步共利用的比例约为1/8。

[0057]本发明以木糖利用重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS，ura3,RPE1::TRP1)为出发菌株，在其中酿酒酵母内源启动子TPI1p以表达载体游离型多拷贝质粒pRS425K过表达内源基因ZWF1，得到菌株SyBE_Sc122001。用该菌株做木糖、葡萄糖混糖限氧培养发酵，发酵结束用HPLC测定培养基中的成分，结果显示在葡萄糖耗尽时，木糖、葡萄糖同步共利用的比例约为1/8。

[0058]本发明优选以OD600＝1.0做为发酵初始接种量。种子培养基为合成培养基SC-Leu，发酵培养基为YP(D+X)，其中换用另外两种启动子(TDH1p、TEF1p)以同样的方式做过表达也能实现类似的效果。所述所选启动子为TPI1p，在本 发明的一些实施例中，所选启动子为TDH1p，在本发明的另一些实施例中，所选启动子为TEF1p。

[0059]用接种环从生长于SC-Leu固体平板上的SyBE_Sc122001及对照菌株单菌落挑取一环接种于3～5ml SC-Leu液体培养基中，30℃，220rpm培养24～36h，此培养物为一级种子。[0060]一级种子培养结束后，转接于装有60～80ml SC-Leu液体培养基的250ml广口锥形瓶中，转接后OD600控制在0.1～0.15，30℃，220rpm培养14～18h，此培养物为二级种子。[0061]二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。发酵用培养基为YP(D+X),配方为蛋白胨20g/L，yeast extract 10g/L，木糖20g/L，葡萄糖80g/L，发酵培养基的量为100ml。接种具体方法为：测量二级种子培养物OD600值，按发酵培养接种浓度为OD600＝1计算接种量。用无菌的50ml离心管5000rpm离心8min(4℃)，弃上清，30ml无菌水洗涤1次，再次按上述条件离心，弃上清，用5ml发酵培养基将细胞冲洗到发酵用250ml细口锥形瓶中。30℃，150rpm条件下进行发酵。

[0062]发酵过程中每6h进行取样分析，HPLC条件：Bio-Rad Aminex HPX–87H色谱柱，柱温65℃，流动相为5mmol H2SO4，流速0.6ml/min，每个样品运行24min。[0063]结果表明，发酵培养基中葡萄糖浓度为80g/L，木糖浓度为20g/L时，木糖、葡萄糖同步共利用的比例为1/8.6938，而对照株的这一比例为1/10.283。本发明提供的菌株、其制备方法及应用，以及该菌株的发酵方法中所用原料及试剂均可由市场购得。其中，所用底盘菌株为重组酿酒酵母SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS，ura3；RPE1::TRP1)。所用表达载体为游离型多拷贝质粒pRS425K。过表达ZWF1所选启动子为酿酒酵母内源启动子TPI1p。

[00]本专利有两个对照菌株：第一个对照菌株用在实施例1、2、3中，获得方式为：在SyBE_Sc17004中表达空载体pRS425k，命名为“对照”；第二个对照菌株用在实施例4中，获得方式为在SyBE_Sc17002(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3)中表达空载体pRS425k，命名为SyBE_Sc122033。

[0065]下面结合实施例，进一步阐述本发明：[0066]实施例1

[0067]以木糖利用重组酿酒酵母菌株SyBE_Sc17004(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS，ura3；RPE1::TRP1)为出发菌株，在其中酿酒酵母内源启动子TPI1p以表达载体游离型多拷贝质粒pRS425K过表达内源基因ZWF1，得到菌株SyBE_Sc122001。

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用该菌株做木糖、葡萄糖混糖限氧培养发酵：

[0069]本发明优选以OD600＝1.0做为发酵初始接种量。种子培养基为合成培养基SC-Leu，发酵培养基为YP(D+X)。

[0070]用接种环从生长于SC-Leu固体平板上的SyBE_Sc122001及对照菌株(在SyBE_Sc17004中表达空载体pRS425k得到)单菌落挑取一环接种于3～5ml SC-Leu液体培养基中，30℃，220rpm培养24～36h，此培养物为一级种子。[0071]一级种子培养结束后，转接于装有60～80ml SC-Leu液体培养基的250ml广口锥形瓶中，转接后OD600控制在0.1～0.15，220rpm培养14～18h，此培养物为二级种子。30℃，[0072]二级种子培养结束后，进行发酵培养基的接种。发酵用培养基为YP(D+X),配方为蛋白胨20g/L，yeast extract 10g/L，木糖20g/L，葡萄糖80g/L，发酵培养基的量为100ml。接种具体方法为：测量二级种子培养物OD600值，按发酵培养接种浓度为OD600＝1计算接种量。用无菌的50ml离心管5000rpm离心8min(4℃)，弃上清，30ml无菌水洗涤1次，再次按上述条件离心，弃上清，用5ml发酵培养基将细胞冲洗到发酵用250ml细口锥形瓶中。30℃，150rpm条件下进行发酵。发酵条件为限氧培养，控制方法为用插有7号针头的5号橡胶塞塞住发酵用250ml细口锥形瓶。

[0073]发酵过程中每6h进行取样分析，HPLC条件：Bio-Rad Aminex HPX–87H色谱柱，柱温65℃，流动相为5mmol H2SO4，流速0.6ml/min，每个样品运行24min。[0074]发酵结束用HPLC测定培养基中的成分。请见图4。结果显示在葡萄糖耗尽时，木糖、葡萄糖同步共利用的比例为1/8.6938。而对照株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例为1/10.283。

[0075]原始实验数据请见表3、表4。[0076]表3 对照菌株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例

[0077]

[0078][0079]

表4 SyBE_Sc122001菌株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例

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结果显示，取24h样品点计算菌株木糖葡萄糖同步共利用的比例，对照菌株这一比

例为：7.5246000240587/77.37617＝1/10.283，SyBE_Sc122001的这一比例为：9.31553/80.98729＝1/8.6938。

[0081]与对照菌株相比，本发明提供的菌株SyBE_Sc122001在混糖发酵中，木糖、葡萄糖同步共利用的比例显著(P＜0.05)提高。[0082]实施例2

[0083]将过表达所用启动子更换成TDH1p，所得菌株为SyBE_Sc122006，按实施例1的条件发酵、取样、检测。

[0084]发酵结束用HPLC测定培养基中的成分。请见图5。经HPLC测样分析，木糖、葡萄糖同步共利用的比例为1/8.4328。而对照株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例为10.283。[0085]原始实验数据请见表5、表6。[0086]表5 对照菌株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例

[0087]

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表6 SyBE_Sc122006菌株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例

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结果显示，取24h样品点计算菌株木糖葡萄糖同步共利用的比例，对照菌株这一比

例为：7.5246000240587/77.37617＝1/10.283，SyBE_Sc122006的这一比例为：9.770992/82.39735＝1/8.4328。

[0091]与对照菌株相比，本发明提供的菌株SyBE_Sc122006在混糖发酵中，木糖、葡萄糖同步共利用的比例显著(P＜0.05)提高。[0092]实施例3

[0093]将过表达所用启动子更换成TEF1p，所得菌株为SyBE_Sc122009，按上述条件发酵、取样、检测。

[0094]发酵结束用HPLC测定培养基中的成分。请见图6。经HPLC测样分析，木糖、葡萄糖同步共利用的比例为1/8.5846。而对照株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例为1/10.283。[0095]原始实验数据请见表7、表8。[0096]表7 对照菌株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例

[0090][0097]

[0098][0099]

表8 SyBE_Sc122009菌株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例

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结果显示，取24h样品点计算菌株木糖葡萄糖同步共利用的比例，对照菌株这一比

例为：7.5246000240587/77.37617＝1/10.283，SyBE_Sc122009的这一比例为：9.603272/82.43997＝1/8.5846；

[0102]与对照菌株相比，本发明提供的菌株SyBE_Sc122009在混糖发酵中，木糖、葡萄糖同步共利用的比例显著(P＜0.05)提高。[0103]实施例4

[0104]在SyBE_Sc17002(L2612,delta::XYL1,XYL2,XKS,ura3)中表达空载体质粒pRS425k得到菌株为对照菌株，命名为SyBE_Sc122033；在SyBE_Sc17002中过表达启动子TPI1p控制下的ZWF1得到菌株命名为SyBE_Sc122034；在SyBE_Sc17002中过表达启动子TEF1p控制下的ZWF1得到菌株命名为SyBE_Sc122035。[0105]发酵培养过程如实施例1所述，只是把发酵培养基的初糖浓度改为葡萄糖40g/L，木糖20g/L，其余条件皆不变。[0106]发酵结果见图7、图8，以及表9～表11。[0107]表9 SyBE_Sc122033菌株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例

[0108]

[0101]

[0109][0110]

表10 SyBE_Sc122034菌株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例

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[0111]

图7结果显示，取6h样品点计算菌株木糖葡萄糖同步共利用的比例，对照菌株

SyBE_Sc122033这一比例为：0.4145/10.7936＝1/22.066，SyBE_Sc122034的这一比例为：2.378256/16.99553＝1/7.146；

[0113]表11 SyBE_Sc122035菌株的木糖、葡萄糖同步共利用的比例

[0112][0114]

图8结果显示，取6h样品点计算菌株木糖葡萄糖同步共利用的比例，对照菌株

0.4145/10.7936＝1/22.066，SyBE_Sc122035的这一比例为：SyBE_Sc122033这一比例为：

1.52406/13.19278＝1/8.656。[0116]与对照菌株相比，本发明提供的菌株SyBE_Sc122034、SyBE_Sc122035在混糖发酵中，木糖、葡萄糖同步共利用的比例显著(P＜0.05)提高。[0117]可见，在其他菌株中过表达内源基因ZWF1也能够提高葡萄糖、木糖同步共利用过程中木糖的比例。

[0118]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

[0115]

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