维普资讯 http://www.cqvip.com ２００７，２３（１Ｉ） 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ １１４３ 文章编号：１００２—２６９４（２００７）ｌ１一ｌ１４３—０４ 恶性疟原虫海南分离株ＰＪ’ｍｄｒｌ基因 与氯喹抗性的相关性分析 于 丹 ，江钢锋 ，陈沛泉 摘要：目的 了解海南省恶性疟原虫ｐｆｍｄｒｌ基因同氯喹抗性的关系。方法 采用套式ＰＣＲ技术特异性扩增ｐｆｍｄ １ ４２个样本中，Ｐ ｄ １ 基因含有编码第８６位、１０４２位和１２４６位氨基酸的基因片段．并对扩增产物进行ＲＦＬＰ分析。结果第８６位氨基酸均未发生突变。即８６位氨基酸是野生型的Ａｓｎ，而不是突变型的Ｔｙｒ。第１２４６位氨基酸发生突变的样本共有 ７个・全部为抗性虫株。第１０４２位点ＰＣＲ扩增结果阳性的３７个样本中突变的样本共有１Ｏ个，其中９个为抗性虫株．一个为 敏感虫株。结论 我国海南省恶性疟原虫氯喹抗性产生与Ｐｆ．ｚｄｒｌ ８６位氨基酸基因多态性无关，但第１０４２和１２４６位氨基 酸的突变更易在抗性虫株中检出。 关键词：恶性疟原虫；ｐｆｍｄｒｌ基因；氯喹抗性 中图分类号：Ｒ３８２．３文献标识码：Ａ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｐｆｍｄｒ－１ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ Ｊ＇ａｌｃｉｐａｒｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｈａｉｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ＹＵ Ｄａｎ，ＪＩＡＮＧ Ｇａｎｇ—ｆｅｎｇ，ＣＨＥＮ Ｐｅｉ—ｑｕａｎ （Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５ １０００６，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｉｔ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｉｎｃｌｕｄｅｄ Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｐｆｍｄ￣ｌ，ｃｇ一２ ｇｏｎｅ ａｎｄ Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｐｆｃｒｔ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｏｒ ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｐ．＿厂ｎｌｃｉｐａｒｕｍ．Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ，ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ— ｐｈｉｓｍ ｉｎ ｔｈｅ ｐｆｍｄ￣ｌ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ｈａｉｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ＰＣＲ－ＲＦＬＰ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｌａ— ｔｉｏｎｓｈｉｐ ｏｆ ｐｆｍｄ￣ｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｔｈｅ ｆｒａｇ— ｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｆｍｄｒ－１ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ８６。１０４２ ａｎｄ １２４６ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌ ｒｅ— ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｉｎ ｏｕｒ ｓｔｕｄｙ。４２ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ，ｉｎ ｗｈｉｃｈ ２２ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｂｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ．Ａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｂｙ ＰＣＲ—ＲＦＬＰ，７ ｏｕｔ ｏｆ ４２ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｔｈｅ Ｄ１２４６Ｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｗｅｒｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ：ｔＯ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ．Ｅｘｃｅｐｔ ５ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ，３７ ＯＵｔ ｏｆ ｔｈｅ ４２ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｈａｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ １０４２ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｉｎ ｔｈｅｓｅ ３７ ｉｓｏｌａｔｅｓ。１０ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｈａｄ ｔｈｅ Ｎ１０４２Ｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ。９ ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｗｏｒｅ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ。ａｎｄ ｏｎｌｙ ｏｎｅ ｗａｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ，ｓｕＲｇｅｓｔｉｎｇ ａ ９０ ａｇｒｅｅｍｅｎｔ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ， ｉｔ ｓｅｅｍｓ ｔｈａｔ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃａｎ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｏｆ Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｉｎ Ｈａｉｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｆｍｄ￣ｌ ｇｅｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ａｔ ８６ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ，ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｄ１２４６Ｙ ａｎｄ Ｎ１０４２Ｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｅｘｉｓｔ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ；Ｐｆ．ｚｄｒｌ ｇｅｎｅ；ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ 氯喹作为一种高效、低价的抗疟药，因其良好的 安全性和耐受性曾在临床上发挥重要作用。但在 ２Ｏ世纪５Ｏ年代泰国和哥伦比亚同时发现恶性疟原 虫氯喹抗性后至今除了海地岛和西南亚的部分地区 外其抗药性已经遍布全球“ 。我国海南、云南、广 西等地也有氯喹抗性疟疾的流行。已有研究推测抗 性虫株基因组的改变，包括药物作用靶点、同药物吸 收／外排相关的物质通道、离子通道编码基因等的改 变都可能引发抗性，而且氯喹抗性产生是一个多基 因作用的结果。目前发现同该过程相关的基因主要 有恶性疟原虫多药抗性基因（Ｐ． 通讯作者；江钢锋，Ｅｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｇｆ＠ｔｏｍ．ｃｏｎｌ ｌｃｉｐａｒｕｍ ｍｕｌ一 作者单位：１．广东药学院寄生虫学教研室，广州 ５ｌ０００６； ２．广州中医药大学热带医学研究所 维普资讯 http://www.cqvip.com １１４４ 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａ１ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｐｆｍｄｒ１），ｃｇ２基因和恶性疟原虫 氯喹抗性转运蛋白编码基因（Ｐ． ｌｃｉｐａｒｕｍ ｃｈｌｏｒ— ｏｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ，ｐｆｃｒｔ）∞ 。这些基因 因公司完成。 ２ 结 果 ２．１ 药物敏感性测试结果４２份疟疾患者血样经 或协同作用赋予恶性疟原虫氯喹抗性 “ 。 体外药物敏感性测试，其中具有氯喹抗性的虫株有 ２２个，氯喹敏感的虫株有２Ｏ个。 ２．２ ８６位点测试结果４２份血样经套式ＰＣＲ扩增 本文对海南省恶性疟原虫氯喹抗性相关基因 ｐｆｍｄｒｌ进行多态性分析，以进一步了解该基因同 氯喹抗性之间的关系，对开展抗性疟原虫分子流行 含有编码８６位氨基酸的ｐｆｍｄｒｌ基因片段，全部为 阳性，片段大小约为５２０ｂｐ。用性内切酶Ａｐｏ 病学分析及深入了解疟原虫抗药性产生机制具有重 要参考价值。 １材料与方法 １．１虫株来源采集海南省恶性疟流行区门诊病 人经镜检确诊为恶性疟患者的血样。将血样置于灭 菌的１．５ｍｌ离心管中，一２Ｏ℃保存备用。 １．２药物敏感性测试采用改良的ｗＨＯ推荐的 Ｒｉｅｃｋｍａｎｎ体外微量测定法 对采集的４２份恶性 疟病人血样进行氯喹的敏感性测试。 １．３基因组ＤＮＡ的提取每份血样取５Ｏ ｌ血置于 灭菌的１－５ｍｌ离心管中，加入５００￣１磷酸钠缓冲液 剧烈震荡后１０ ０００ｒ／ｍｉｎ，离心ｌＯｍｉｎ，弃上清液。 重复上述步骤两次后加５Ｏ ｌ三蒸水悬浮沉淀，沸水 浴１０ｍｉｎ，５ ０００ｒ／ｍｉｎ，离心ｌＯｍｉｎ，吸取上清，４。Ｃ保 存备用 。 １．４ 目的基因的扩增 根据参考文献 ”分别设 计２对引物（表１）扩增含有８６、１０４２、１２４６位点的 基因片段。５Ｏ ｌ反应体系中包含５ ｌ模板ＤＮＡ，１ ×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，２．５ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭｇＣ１２（ＭＢＩ），０．２ ｍｍｏｌ／Ｌ的ｄＮＴＰ，各０．５ｍｍｏｌ／Ｌ的上下游引物和 １．２５Ｕ的Ｔａｇ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＭＢＩ）。第１次反 应条件：９４℃预变性２ｍｉｎ，９２℃变性３０ｓ，４８。Ｃ退火 ４５ｓ，６５℃延伸ｌｍｉｎ，共３Ｏ个循环，循环结束后６５℃ 延伸５ｒａｉｎ。以第１次反应产物为模板进行第２次 反应：９４℃预变性２ｍｉｎ，９２ Ｃ变性３０ｓ，４８。Ｃ退火 ３０ｓ，６５℃延伸４５ｓ，共３Ｏ个循环，循环结束后６５℃ 延伸５ｒａｉｎ。扩增产物经２ 琼脂糖凝胶电泳观察分 析。 １．５ 扩增产物的酶切Ｐｆｍｄｒｌ基因的８６位点用 性内切酶Ａｐｏ Ｉ进行酶切分析，可酶切野生型 基因；１０４２位点用性内切酶Ａｓｅ Ｉ进行酶切分 析，可酶切野生型基因；１ ２４６位点用性内切酶 ＥｃｏＲＶ进行酶切分析，可酶切突变型基因。酶切产 物经２ ９／６琼脂糖凝胶电泳后，紫外分析仪观察结果 并拍照。 １．６ 目的基因片段的序列测定Ｐｆｍｄｒｌ基因 ８６、ｌ ０４２、ｌ ２４６三个位点各挑选几个样本的第二次 ＰＣＲ扩增产物进行ＤＮＡ测序，该工作交由拓扑基 Ｉ消化扩增产物，所有样本均被切开，酶切后ＤＮＡ 片段大小约为２２０ｂｐ和３００ｂｐ（图１）。表明所有虫 株的ｐｆｍｄｒｌ基因均为野生型，即８６位氨基酸是 Ａｓｎ，而不是突变型Ｔｙｒ。 图１ Ｐｆｍｄｒｌ基因Ｎ８６Ｙ点突变酶切电泳结果 Ｆｉｇ．１ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐｆｍｄｒｌ ｇｅｎｅ Ｎ８６Ｙ ｍｕｔａ‘ ｔｉｏｎ． １：ＰＣＲ产物对照；２：ＡｐｏＩ酶切产物；Ｍ：ｐＵＣ Ｍｉｘ８ 分子质量标记 ｌ：Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ；２：ｐｆｍｄｒｌ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉ－ ｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ａｐｏ Ｉ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；Ｍ：ｐＵＣ Ｍｉｘ８ ｍａｒｋｅｒ． ２．３ １０４２位点测试结果 有３７份血样经套式 ＰＣＲ扩增得到含有编码１０４２位氨基酸的ｐｆｍｄｒｌ 基因片段，片段大小约为３５０ｂｐ（图２ａ），性内切 酶Ａｓｅ Ｉ消化后，１０４２位点基因型为野生型者形成 两个约１２０～１３０ｂｐ的片段和两个约５０ｂｐ的小片 段，突变型者形成一个约２５０ｂｐ的大片段和两个约 ５０ｂｐ的小片段（图２ｂ）。２１个抗性株中有９个证实 为突变型Ｃｙｓ（４１ ），其余为野生型（５９ ）；１６个 敏感株中有１个为突变型（５％），其余为野生型 （９５ ）（校正Ｙ。＝４．４５，大于．）［８．ｏ５—３．８４，Ｐ＜ ０．０５）。 ２．４ １ ２４６位点测试结果 ４２份血液样本经套式 ＰＣＲ扩增含有编码１２４６位氨基酸的ｐｆｍｄｒｌ基因 片段，全部为阳性，片段大小约为４１０ｂｐ。用性 内切酶ＥｃｏＲＶ消化扩增产物，有７个样本具有酶切 位点为突变型，酶切后ＤＮＡ片段大小分别约为 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ｌｌ４５ ２１０ｂｐ和２００ｂｐ（图３）。所有７个突变型都是抗性 株（３２ ９，６），其余为野生型（６８ ）；所有敏感株都为野 生型（校正ｘ 一５．５２，大于 。５—３．８４，Ｐ＜０．０５）。 Ｍ １ ２ ３ ｌ １ １ ８１ ６９２ ５０１ ４８９ ４０４ ３３１ ２４２ 图２ａ Ｐｆｍｄｒｌ基因Ｎ１０４２Ｄ点突变第二次ＰＣＲ反应电泳 结果 Ｆｉｇ．２ａ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｆｍｄｒｌ ｇｅｎｅ Ｎ１０４２Ｄ ｍｕｔａ— ｔｉｏｎ． 卜３：ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｐｆｍｄｒｌ ｇｅｎｅ Ｎ１０４２Ｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ；Ｍ：ｐＵＣ、ｌｉｘ８ ｍａｒｋｅｒ． Ｍ １ ２ ３ ４ ｌ ｌ１ ｓ８１ ６９２ ５０１ １８９ １０４ ３３１ ２４２ ｌ９０ １４７ １１１ 图２ｂ ｌｄｒｌ基因Ｎ１０４２Ｄ点突变酶切电泳结果 Ｆｉｇ．２ｂ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐｆｍｄｒｌ ｇｅｎｅ Ｎ１０４２Ｄ ｎｍｔａ。 ｔｉｏｎ． １。３：ｍｕｔａｎｔｏｈｙｐｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅ— ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；２．４：ｗｉｄｅ－ｔｙｐｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ａｓｅ Ｉ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅ。 ａｓｅ；Ｍ：ｐＵＣ Ｍｉｘ８ ｍａｒｋｅｒ． ２．５测序结果８６位点Ｋ３等２个样本的ＰＣＲ产 物、１０４２位点Ｋ５等７个样本的ＰＣＲ产物、１２４６位 点Ｋ２ｏ等６个样本的ＰＣＲ产物测序结果证明各个 位点的基因序列与酶切结果相符。 ３讨论 早期研究发现位于５号染色体上的恶性疟原虫 多药抗性基因（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔ。 ａｎｔｅ，ｐｆｍｄｒ１），由它编码的１６０ｋＤａ Ｐ型糖蛋白（Ｐ— ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌ，Ｐｇｈ—１）在氯喹外排或吸收中发挥作 用，并认为与氯喹抗性产生有关，具体机制可能如 下：１．基因拷贝数增加致使合成蛋白量增加。２．给 药压力下ｐｆｍｄｒｌ基因的表达量增加。３．该基因特 １ ｌ ２ １ ９ ４ ｌ ２ ０ ７ 图３ Ｐ，小ｄｒｌ基因ＤＩ２４６Ｙ点突变酶切电泳结果 Ｆｉｇ．３ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐｆｍｄｒｌ ｇｅｎｅ Ｄ１２４６Ｙ ｍｕｔａ— ｔｉｏｎ． １：Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ；２：ｐｆｍｄｒｌ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｅｃ０ＲＶ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｅｌｅａｓｅ： ３：ｐｆｍｄｒｌ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ Ｅｃ０ＲＶ ｒｅ— ｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ；Ｍ：ｐＵＣ Ｍｉｘ８ ｍａｒｋｅｒ． 定位点突变导致蛋白功能增强。 。ＰＲＩＣＥ等人认 为由于Ｐｆｍｄｒｌ基因扩增，其蛋白产物也相应增 加，导致氯喹外排速度加快从而产生抗性ｎ ；与之 相反，另一些实验表明，Ｐｆｍｄｒｌ基因表达产物量增 加的同时，其拷贝数并没有发生变化ｎ 。不少研究 认为同氯喹抗性相关的突变位点主要有 “８６Ｔｙ 、Ｔｙ １８４ ￣Ｓｅｒ１０３４ｃｙ。、 “１０４２ 和 ｓｐ１２４６ Ｔｙ ，其中８６位 点被认为是氯喹抗性产生的关键性突变位点，但是 这些突变同氯喹体内、体外抗性关系的现场研究结 果很不一致。ＶＡＮ 们等认为ｐｆｍｄｒｌ的基因突变 导致编码产物Ｐｇｈｌ的功能损伤，使得氯喹摄入量 减少而表现出抗性。近年来的研究发现ｐｆｍｄｒｌ基 因８６位点的突变同氯喹抗性高低具有一定关系，但 不显著“ ＂ 。ＤＪＩＭＤＥ等人的体内实验发现在氯 喹治疗失败的病人体内ｐｆｍｄｒｌ基因８６位点的突 变率为８６ ，高于基线５０ ９，６ 。单个位点的突变同 疟原虫抗药性的关系不密切，而二个位点甚至多个 位点间的协同作用可能是抗药性产生的真正原因。 本文对４２个海南株恶性疟原虫ｐｆｍｄｒｌ基因 若干位点的多态性进行分析，结果显示，１０４２位点 和１２４６位点突变多见于氯喹抗性虫株中（表２），显 示ｐｆｍｄｒｌ的１０４２位点和１２４６位点的突变同氯喹 抗性具有一定关系。此外，在１０４２位点的ｌ０个突 变株和１２４６位点的７个突变株中同时发生二者突 变的有３个样本，仅占抗性虫株的ｌ４ ，但在发生 突变的抗性虫株中分别占了３３ ９，６（３／９）和４３ （３／ ７）。值得一提的是，本研究及作者以前的另一研究 均未发现海南株恶性疟原虫存在Ｎ８６Ｙ位点突变， 即全部虫株均为野生型，而同样对恶性疟原虫海南 株的研究，官亚宜等㈣则检测到Ｎ８６Ｙ位点突变 维普资讯 http://www.cqvip.com ｌｌ４６ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ 中国人兽共患病学报 ２００７，２３（１１） （仅占样本量的３．４％），尽管其突变与氯喹抗性不 存在关联。这可能同两个研究样本采集的时间和具 情况。综合相关的研究结果，我们认为我国海南省 恶性疟原虫虫株ｐｆｍｄｒｌ基因的某些位点的突变与 体地点不同有关，但因所研究的样本数量均不够大， 所以并不一定能反映海南省恶性疟原虫种群的真实 氯喹抗性并不存在必然的联系，不能用作氯喹抗性 的分子标记。 表１用于扩增ｐｆｍｄｒｌ基因的引物 Ｔａｂ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｆｍｄｒｌ ｇｅｎｅ 表２ １０４２位点和１２４６位点基因型及氯喹抗性 Ｔａｂｌｅ ２ Ｐａｒａｓｉｔｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｔｏ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｐｏｌｙ— ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ａｍａ— ｚｏｎ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ Ｂｒａｚｉｌ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｑｕｉｎｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｊ３．Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ，１９９８，５８（５）：６３０—６３７． ｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ １０４２ ａｎｄ １２４６ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｆｍｄｒｌ ｇｅｎｅ． ［１１３ Ａｄａｇｕ Ｉ Ｓ，Ｗａｒｈｕｒｓｔ Ｄ Ｃ．Ａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｎｅｓｔｅｄ，ｏｎｅ ｔｕｂｅ ＰＣＲ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｆｍｄｒｌ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｊ３．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，１９９９，１１９：卜６． ［１２３Ｐｒｉｃｅ ＰＮ，Ｕ『ｈｌｅｍａｎｎ ＡＣ，Ｂｒｏｃｋｍａｎ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｍｅｆｌｏｑｕｉｎｅ ｒｅ— ｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｃｉｐａｒｕｍ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｐｆｍｄｒｌ ｇｅｎｅ ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ（Ｊ３．２００４，３６４（９４３２）：４３８—４４７． ［１３￣Ｅｋｏｎｇ Ｒ Ｍ，Ｒｏｂｓｏｎ Ｋ Ｊ Ｈ，Ｂａｋｅｒ Ｄ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｍｈｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ－ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｈｏ— 参考文献： ［１］Ｂａｉｒｄ Ｊ Ｋｅｖｉｎ。Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｄｒｕｇｓ．Ｔｈｅ ｎｅｗ ｒｏｑｕｉｎｅ—ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ［Ｊ］．Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ． １９９３，１０６：１０７—１１５． Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａＩ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｊ３．Ｎ ＥｎｇＩ Ｊ Ｍｅｄ，２００５，３５２： １５６５—１５７７． （１４３Ｖａｎ Ｅｓ ＨＨ，Ｋａｒｃｚ Ｓ，Ｃｈｕ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｏｄｉ— ｕｎｌ ｐｆｍｄｒｌ ｇｅｎｅ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． １ ９９４， １４：２４１９． （２３ Ｔａｌｉｓｕｎａ Ｏ Ａｍｂｒｏｓｅ，Ｂ１ｏｌａｎｄ Ｐｅｔｅｒ，Ａｌｅｓｓａｎｄｒｏ Ｄ Ｕｍｂｅｒｔｏ． Ｈｉｓｔｏｒｙ，Ｄｙｎａｍｉｃｓ，ａｎｄ ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｍａｌａｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｊ３．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｖｉｅｗｓ。２００４。１ ７ （１）：２３５－２５４． ［１５］Ｏｃｈｏｎｇ Ｏ Ｅｄｗｉｎ，Ｋｅｕｓ Ｋｅｅｓ，Ｎｚｉｌａ Ａｌｅｘｉｓ，ｅｔ ａ１．Ｓｈｏｒｔ ｒｅ— ｐｏｒｔ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ａｎｄ ａｍｏｄｉａｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔ— （３３ Ｓｈａｒｍａ Ｙ Ｄ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ａｎｃｅ ａｎｄ ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ Ｊａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍｕｌｔｉ— ｐｉｅ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ １ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｎｓ— ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｌｃｉｐａｒｕｍ（Ｊ３．Ｉｎｄｉａｎ Ｊ Ｍｅｄ Ｒｅｓ，２００５：１３—２２． （４３Ｗｈｉｔｅ Ｊ Ｎｉｃｈｏｌａｓ．Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｊ３．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００４，１１３（８）：１０８４—１０９２． ｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｕｐｐｅｒ ｎｉｌｅ ｉｎ ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｓｕｄａｎ （Ｊ３．Ａｍ Ｊ Ｔｒｏｐ Ｍｅｄ Ｈｙｇ，２００３，６９（２）：１８４—１８７． （１６］Ｂａｂｉｋｅｒ Ａ Ｈａｍｚａ，Ｐｒｉｎｇｌｅ Ｊ Ｓ，Ｍａｃｋｉｎｎｏｎ Ｍ，ｃｔ ａ１．Ｈｉｇｈ—ｌｅｖｅｌ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｓｕｄａｎｅｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ Ｚ— ｃｉｐａｔ・ｕｍ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔ・－ （５３ Ｒｉｅｃｋｍａｎｎ ＫＨ。Ｓａｘ ＬＪ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＧＨ，ｅｔ ａ１．Ｄｒｕｇ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｉｃｒｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ， １９７８，１（８０５４）：２２—２３． （６３陈沛泉，何坤荣，彭南正．等．海南省东方市恶性疟原虫对氯喹 敏感性的体外检测（Ｊ３．热带医学杂志，２００３，３（２）：１６７—１６８． （７３Ｆｏｌｅｙ Ｍ，Ｒａｎｆｏｒｄ—Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ ＬＣ，Ｂａｂｉｋｅｒ ＨＡ．Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｉｍ— ｐｉｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｍａｌａｒｉａ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｃｋ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎｃｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｐｆｃｒｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｕｈｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｐｆｍｄｒｌ（Ｊ３．Ｔｈｅｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００１，１８３；１５３５— １５３８． ［１ ７３ Ｃｏｊｅａｎ Ｓａｎｄｒｉｎｅ，Ｎｏｅｌ Ａｌａｉｎ，Ｇａｒｎｉｅｒ Ｄｉｍｉｔｒｉ，ｅｔ ａ１．Ｌａｃｋ ｏｆ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐａｒａｓｉｔｏｌ，１９９２，５３：２４１—２４４． （８３ Ｄｊｉｍｄｅ Ａ，Ｐｈａｒｍ Ｄ，Ｄｏｕｍｂｏ ＯＫ，ｅｔ ａ１．Ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ ｆｏｒ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ ｍａｌａｒｉａｌ［Ｊ］．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２００１，３４４：２５７－２６３． ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ｛ｕｌｃｉｐａｒｕｍ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｉｍｐｏｒｔｅｄ ｍａｌａｒｉａ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｆｒｏｍ Ａｆｒｉｃａ（Ｊ３．Ｍａｌａｒ Ｊ，２００６，５：２４． （１８３官亚宜，汤林华，胡铃，等．海南恶性疟原虫分离株 ｒｔ和 （９３ Ｄｏｒｓｅｙ Ｇ。Ｋａｍｙａ ＭＲ，Ｓｉｎｇｈ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ Ｐｌａｓ— ｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ Ｐｆｃｒｔ ａｎｄ Ｐｆｍｄｒ－１ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｆｍｄｒｌ基因点突变的研究（Ｊ３．中国寄生虫学与寄生虫病杂 志，２００５，２３（３）：１３５—１３９． ｔｏ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｉｎ Ｋａｍｐａｌａ。Ｕｇａｎｄａ（Ｊ３．ＪＩＤ，２００１，１８３；１４１７． ［１０３ Ｍａｒｉａｎｏ Ｇ Ｚａｌｉｓ，Ｌｏｒｒｉｎ Ｐａｎｇ，Ｍａｒｉａｎａ Ｓ Ｓｉｌｖｅｉｒａ，ｅｔ ａ１．Ｃｈａｒ— 收稿日期：２００７－０２—０７：修回日期：２００７—０５—１４
