维普资讯 http://www.cqvip.com 中国矫形外科杂志２００２年６月第９卷第７期Ｏｒｔｈｏｐ Ｊ Ｃｈｉｎ，Ｖｏ１．９，Ｎｏ．７ Ｊｕｎｅ ２００２ 组织工程用山羊胫骨骨缺损模型的制备△ 王摘要珂裴国献陈 滨 金丹魏宽海胡罢生 马中立 目的：制备骨组织工程用中国青山羊胫骨骨缺损模型。方法：中国青山羊９只随机分３组制备单侧胫骨２０ｒａｍ的骨膜与骨 缺损，钢板内固定，术后放射性同位索、放射学检查、组织学方法评价骨缺损自行修复情况。结果：术后同位素ＲＯＩ记数（Ｐ＞Ｏ．０５）与摄 取比值Ｔ小ｒｒ（Ｐ＞０．０５）显示无骨代谢，所有动物骨缺损处ｘ线片Ｌａｎｅ评分均为０分，组织学显示无骨组织长人。结论：山羊胫骨 ２０ｍｍ缺损模型不能自主成骨，符合骨组织工程实验的要求。 关键词羊；骨缺损；模型 Ｒ《谗３．４２ 文献标识码Ａ 文章编号ｌｏ０５—８４７８（２ｏｏ２）Ｏ７一ｏ６６４一Ｏ３ 中图分类号Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃａｐｒｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ｔｉｂｉａ Ｄｉａｐｈｙｓｅａｌ Ｄｅｆｅｃｔ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｔｉ￣ｌｌｉｅ Ｅｎｅ￣ａｅｃｒｉｎｇ，，ＷＡＮＧ Ｋｅ．｝｝ＥＩ Ｇｕｏ－ｘｉａｎ，ＣＨＥＮ Ｂｉｎ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｐａｒｔｎｗｎｔ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ ａｉｍ Ｔｒａｕｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｆａｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，丁＾ Ｆｉｒｓｔ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ＧＭ，２ ；妫ｏ“，Ｃｏｚａｎｇｄｏｎｇ ５１０５１５ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｒｅ：Ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｃａｐｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｉｂｉａ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｍｅｔｌｍｄｓ：１’ｈｅ ｎｉｎｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｃａｐｒｉｎｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｒｅｅ ｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅ ２０ｍｍ ｌｅｆｔ ｔｉｂｉａ ｄｉａｐｈｙｓｅａｌ ｄｅｆｅｃｔ ｏｆ ｅｖｅｒｙ ｃａｐｒｉｎｅ ｗａｓ ｍａｄｅ ｏｆ ａｎｄ ｆｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ｐｌａｔｅ．Ｂｏｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｎｄ ａｂｌｏｏｄ ｓｕｐｐｌｙ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ＥＣＴ．Ｘ－ｒａｙ ｎｄ ｈｉａｓｔｏｌｏｇｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：１’ｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ０ｆ Ｒ０Ｉ ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ０ｆＴ ｓｈｏｗｅｄ ｎｏ ｂｏｎｅ ｍｅｔａｈｏｌｉｓｍ． Ｔｈｅ Ｌａｎｅ’ｓ ｓｃｏｒｅｓ ｏｆ ｎｉｎｅ ｃａｐｒｉｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｌｌ ｚｅｒｏ．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏｔ Ｉｘｍｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｃａｐｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ２０ｍｍ ｔｉｂｉａ ｄｉａｐｈｙｓｅａｌ ｄｅ． ｆｅｃｔ ｃａｎｎｏｔ ｂｅ ｒｅｐａｉｒｅｄ ｂｙ ｉｔｓｅｌｆ ａｎｄ ｃａｎ ｓａｔｉｓｆｙ ｔｈｅ ｔｉ￣ｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｎｎｇ’Ｓ ｄｅｍａｎｄｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ Ｃａｐｒｉｎｅ； Ｂｏｎｅ ｄｅｆｃｔ；ｅ Ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ 骨组织工程动物实验所用的骨缺损模型有大体动物和小 个体动物之分。常用的小个体动物模型是新西兰大白兔的桡 干长度、中段横径，算出除去放大率后实际值。 １．２．２手术方法动物骨缺损模型的制备与内固定相同，操 作由同一组人员完成。３％戊巴比妥钠静脉麻醉并维持，备 皮，消毒，铺单。下肢前外侧弧形切开皮肤、皮下，分开胫前肌 骨中段１０ｒａｍ以上骨与骨膜缺损的模型Ｌｌ、２ Ｊ，虽然有不需内固 定等优点，但也存在着成骨量少、与实际修复骨缺损环境差距 较大的不足。常用大体动物羊、狗的股骨、胫骨的洞缺性或段 缺性骨缺损模型中，文献报道骨缺损范围、固定形式等条件不 统一。为此，本实验用中国青山羊按临床常用的钢板固定制 与胫骨间隙，保护胫前血管，游离胫骨中段，骨膜与周围软组 织分离，保护周围组织。设计将钢板放置于胫骨外侧、胫前肌 的下面，于放置钢板的位置纵行切开骨膜，适当剥离后于胫骨 备了胫骨段缺性骨缺损的模型，报告如下。 １材料与方法 １．１材料 外侧放置塑形好的ＡＯ自动加压７孔钢板，钢板上端距胫骨结 节１５ｍｍ，空出第４孔，其余孔螺丝钉固定，不拧紧。在钢板第 ３、５孔之间，即距离胫骨结节４５ｍｍ、６７ｍｍ处线锯锯断胫骨和 骨膜，紧固螺丝钉加压，造成２０ｍｍ骨与骨膜缺损，逐层关闭。 切口无菌绷带包扎，不做外固定。术后常规换药，１周内肌注 青霉素８０万 ／ｄ，常规高蛋白青饲料圈养，术后１４ｄ拆线，无异 常后放养，自由活动。 １．３放射性同位素检查 ＧＣＡ－９０１／ＳＡ发射型断层扫描仪（ＥＣＴ），配低能高分辨准 １．１．１实验动物健康中国青山羊９只，由第一军医大学实 验动物中心提供，１２月龄，体重１４．５～１５．５ｋｇ，雌雄不限，雄 性未去势。随机分３组，每组３只，每只羊做单侧肢体。 １．１．２固定材料７孔ＡＯ自动加压钢板，螺丝钉直径２． ５ｒａｍ（常州康辉医疗器械公司生产）。 １．２方法 １．２．１术前准备动物于术前拍双侧胫骨Ｘ线片，测量胫骨 直器检测。３组分别术后２、４、８周肌注速麻安０．０５ｍｌ／ｋｇ麻 醉后，静脉注射 ．ＭＤＰ５毫居／１０ｋｇ，４ｈ后以ｌ帧／Ｓｔａｉｎ采 集一幅静态显像，为延迟相。能峰１４０ｋｅｙ，窗宽２０％，矩阵５１２ △基金项目：国家基础研究发展规划（９７３）项目（Ｇ１９９９０５４３０９） 作者单位：第一军医大学南方医院骨科全军创伤骨科中心，广东广 州５１０５１５ ×５１２，缩放１．０。感兴趣区（Ｒ０Ｉ）同位素记数并计算与对侧的 比值（Ｔ／ＮＴ）。 作者简介：王珂（１９７１．），男，第一军医大学在读硕士研究生，主治医 师。研究方向：骨组织工程。电话：（０２０）８５１４１７４４ １．４放射学检查 所有动物术后４、８、ｌ２周均拍手术肢体正侧位Ｘ线片。 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国矫形外科杂志２００２年６月第９卷第７期Ｏｒｔｈｏｐ Ｊ Ｃｈｉｎ，Ｖｏ１．９，Ｎｏ．７ Ｊｕｎｅ ２００２ ・６６５・ 肌注速麻安０．０５ｍｌ／ｋｇ，麻醉后固定，条件： ＦＯＳＨＩＢＡ的ＫＸＯ— ｌ５Ｒ型Ｘ线机，电压５５ｋＶ，电流５５ｎＬ￣、暴光时间０．３Ｓ，焦距 ９０ｃｍ。所有片子用骨缺损Ｌａｎｅ １３』标准评分，对骨缺损自身的 修复进行量化分析。 １．５组织学检查 观察时相点为术后４、８、ｌ２周。取骨缺损部标本，体积分 数ｌ０％的中性固定，ＥＩ）ＴＡ脱钙，酒精逐级脱水，二 甲苯透明，ＨＥ染色。观察骨缺损自行修复成骨情况。 １．６统计分析 ３组的ＲＯＩ记数与摄取比值Ｔ Ｔ用方差分析。 ２结果 ２ １胫骨长度与横径 共ｌ８侧肢体，胫骨长度范围为（１２６±Ｉ１）ｎｍｌ、横径（１ｌ± １）ｎｍ１ ２．２一般情况 实验动物除一只因术前麻醉过量死亡已予补充外，其余 均存活。术后２～６ｈ苏醒，并能站立进食。术后切口无感染， 无内固定松动失败，皮肤无坏死。术后１周内伤肢能落地，但 不能负重，２周后可以部分负重，３周有轻微跛行，４周后能自 由活动，无跛行。 ２ ３放射性同位素检查 术后２、４、８周３组的Ｉｔ０Ｉ ｉ 数与摄取比值见表ｌ，不同时 间ＲＯＩ记数之问（Ｐ＞０．０５）及摄取比值之问（Ｐ＞０．１）无显著 差异，摄取比值均小于１，说明术侧骨缺损区血供少，无成骨表 现 、 表１ 术后２、４、８周各组ＲＯＩ记数与摄取比值（ｎ＝３。 ｓ） Ｐ＞０．０５： Ｐ＞０．１ ２．４放射学检查 术后４周所有动物骨缺损处均未见有密度增高，远近断 端模糊，有少许骨膜反应，Ｌａｎｅ评分均为０分；术后８周无骨 形成，断端有硬化，髓腔开始有闭合迹象，骨缺损处无密度增 高， ｅ评分０分；术后ｌ２周见骨缺损处与４、８周相比无密 度增高，断端硬化、闭合，残端骨膜反应未加重，Ｌａｎｅ评分０ 分。 ２．５组织学检查 术后４周远近端切片有新生骨痂出现，量少，不规则。骨缺 损处切片见大量结缔组织，未见骨样组织形成；术后８周断端 骨痂量未见增多，骨痂内有骨小梁形成，骨缺损处仍充填大量 结缔组织，无骨组织形成；术后ｌ２周断端骨小梁减少，有密质 骨形成，骨缺损处结缔组织致密，无骨组织。 ３讨论 ． ３．１大动物段缺性骨缺损模型在骨组织工程中的重要性 骨组织工程动物实验中骨缺损模型有多种。按骨缺损的 类型分洞缺性骨缺损和段缺性骨缺损．前者有长骨、高骨和不 规则骨的骨与骨膜缺损，后者是长骨的骨与骨膜缺损；按动物 体积分：羊、狗、猪是常用的大动物，鼠、兔是常用的小动物。 鼠、免的颅骨洞缺性骨缺损模型与兔尺、桡骨段缺性骨缺损模 型在临床前动物实验中是最常用的。狗、猪的下颌骨或股骨 洞缺性骨缺损模型可以在一侧骨上做多个缺损模型，以上模 型均可以用大样本实验，易于统计分析，骨缺损部位不需内固 定，简化了实验操作，减少了影响因素与误差。 以上模型仍难满足临床实验要求，具体表现为成骨量少、 与临床实际不相符。临床发生率较高骨缺损是负重或应力集 中部位的管状骨的大段段缺性骨缺损，多由创伤、感染造成， 治疗难度 。近期发展起来的骨组织工程是将自体种子细 胞体外扩增后与生物材料复合，植入骨缺损部位修复骨缺损， 在理论上是该类型骨缺损修复的最理想治疗模式。从临床的 角度出发，对骨组织工程修复该类型骨缺损的动物模型要求： ①骨缺损量要大；②相似的软组织与力学环境；③考虑内外固 定影响。目前一些骨组织工程研究对成骨量小的模型能得到 比较理想的结果，在成骨量较大的模型上结果不理想，这是因 为种子细胞体外培养的时间短，本身成骨潜能易于保持，如用 于大量骨缺损修复，要求成骨量大，为达到一定数量，种子细 胞的体外培养时间将增加，成骨能力会降低＿５ Ｊ。洞缺性骨缺 损与段缺性骨缺损的生物力学环境是不同的，段缺性骨缺损 的轴向应力会影响新骨的形成，而洞缺性骨缺损缺乏应力的 刺激。按目前技术，较大骨缺损修复后的固定仍必须依靠内 外固定，要考虑不同固定材料、方式与生物材料种子细胞的 相互影响。因此，大体动物长管状骨的段缺性骨缺损模型是 与临床实际最相符合的模型。 ３．２骨缺损模型选择的部位、长度、固定 中国青山羊与狗、猪相比具有易于管理、检测，四肢骨较 长，操作方便等优点，国内外大多采用山羊。山羊股骨与胫骨 都可以用作骨缺损模型，胫骨更符合要求，临床上骨缺损常伴 有周围软组织损伤，血供不充分，因而骨缺损模型不宜在局部 血供丰富的股骨制备，而羊胫骨上段有１／３无肌肉包围，直接 位于皮下，中下段达到ｌ，＇２－－２／３，是比较合适的部位。 羊胫骨骨缺损制备的长度报道不一，根据羊种属、研究目 的等不同有３０－－５０ｎ ‘６， 。还要考虑多个因素：①骨缺损不 能自行愈合；②羊的年龄与个体大小；③骨缺损量的比例；④ 内固定因素。目前羊胫骨缺损不能自行愈合的长度尚无文献 报道，缺损长度增加将带来固定困难、实验观察期延长等一系 列问题。采用ｌ２月龄、体重ｌ４．５～１５．５ｋｇ之问中国青山羊， 胫骨中段距胫骨结节４５ｒｍｎ处按羊肢体长度与钢板长度制备 ２０ｍｍ骨与骨膜缺损，７孔ＡＯ自动加压钢板固定。术后８周 内放射性同位素检测显示术侧的ＲＯＩ放射记数无显著差异， 摄取比值均小于ｌ，说明成骨与血供少于正常侧，无早期成骨 表现。ｌ２周内的ｘ线与组织学检查都证实２０ｍｍ缺损对于羊 是不能自行愈合的，ｌ２周后髓腔几近闭合，更无愈合的可能。 放置钢板是为将骨缺损处空出，充填生物材料种子细胞复合 物。倘用髓内针将占据骨缺损位置，用外固定架不便于术后 管理，都不合适。经测量胫骨的长度（１２６±ｌ１）ｒｆｌｉｌｌ，中段横径 维普资讯 http://www.cqvip.com ・６６６・ 中国矫形外科杂志２００２年６月第９卷第７期Ｏｒｔｈｏｐ Ｊ Ｃｈｉｎ，Ｖｏ１．９，Ｎｏ．７ Ｊｕｎｅ ２００２ （１１±２）ｒｒ￣，７孔ＡＯ自动加压钢板长度为９３ｍｍ，完全可以在 不影响胫骨上下关节的情况下放置在胫骨干皮质段的外侧， 塑形后与胫骨干能很好的贴服。钢板第４个孔空置，第３孔远 【２ Ｊ Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ＪＯ．Ｋｌｅｉｎｓｅｈｍｉｄｔ ＪＣ．Ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｓｉｚｅ ｄｅｆｅｃｔ ａｓ ａｎ ｅｘｐｅｒｉ． ｍｅｎｔ￣ｍｏｄｅｌ ｔｏ ｔｅｓｔ ｂｏｎｅ ｒｅｐａｉｒ ｍａｔｅｒｉａｌｓ［ｊ］．ｊ Ｃｒａｎｉｏｆａｃ Ｓｕｒｇ， １９９０，１（１）：６０－－６８． 端与第５空近端之间的距离足以跨越２０ｍｍ的骨缺损，不影响 相邻螺孔的固定，远近截骨端与钢板远近端的长度各有 ３５ｎｍａ，３个螺钉固定，这样就构成了符合ＡＯ要求的桥形钢 ［３］Ｌａｎｅ ＪＭ，Ｓｃａｎｄｈｕ ＨＳ．Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｇｒａｆｔｉｎｇ［Ｊ］．Ｏｒｔｈｏｐ Ｃ１ｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ，１９８７，ｌ７：２ｌ３～２ｌ５． ［４］许兢斌．骨缺损．见：陆裕朴，主编．实用骨科学［Ｍ］．北京：人民军 医出版社，１９９７，１：６４． ［５］Ｂａｎｆｆ Ａ，Ｍｕｒａｇｌｉａ Ａ，Ｄｏｚｉｎ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒ． ｎｔｉｅａｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ Ｂｌａｌ＇ｒｏｗ ｓｔｒｏｒｎａｌ 板 Ｊ，本实验按此制备的６例２０ｍｍ骨缺损模型及随后的多 例模型中，均未发生内固定失败。预实验中对３０ｍｍ以上缺 损用同样的内固定均失败。由于羊胫骨中段无明显的骨性标 ｃｅｌｌｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔ￣ｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ［ｊ］．Ｅｘｐ－Ｈｅｍａｔｏｌ， ２０００，２８（６）：７０７－－７１５． 志，先截骨后固定很容易发生旋转与分离、短缩移位，本实验 先在完整胫骨上固定钢板，后截骨，考虑自动加压产生的短缩 移位，截骨时预留２ｍｍ，最后紧固。 本实验模型确定了实验动物一般情况、操作细节，尽可能 的减少了误差，具有可操作性、可重复性，是检验骨组织工程 中生物材料／种子细胞复合物成骨能力较好的模型。 参考文献： （１］Ｇｉａｒｄｉｎｏ Ｒ，Ｆｉｎｉ Ｍ，Ｎｉｃｏｌｉ Ａｌｄｉｎｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ，Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ ［６］Ｄｅｎ Ｂｏｅｒ ＦＣ．Ｐａｔｋａ Ｐ，Ｂ＜ｑｋｋｅｒ ＦＣ，ｅｔ ａ１．Ｎｅｗ ｓｅｇｒｎｅｎｔ￣ｌｏｎｇ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔ ｍｏｄｅｌ ｉｎ ｓｈｅｅｐ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｅａｌｉｎｇ ｗｉｔｈ ｄｕａｌ ｅｎｅｒ－ ｇｙ ｘ．ｒａｙ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｒｅｓ，１９９９，１７（５）：６５４－－６６０． ［７］ Ｓｔｕｔｚｌｅ Ｈ，ＨａｌｌｆｅｌｄｔＫ，ＭａｎｄｅｌｋｏｗＨ，ｅｔ ａ１．Ｂｏｎｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｉｍｕ— ｌａｔｄ ｅｂｙ ｂｏｎｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｍａｔｅｒｉａｌｓＯｒｔｈｏｐａｄｅ［Ｊ］．１９９８，２７（２）：１ｌ８～ １２５． ［８］ＭＥＭｕｌｅｒ，Ｍ．Ａｌｌｇｏｗｅｒ，Ｒ．Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，等．骨科内固定［Ｍ］．北京： 人民卫生出版社，１９９５，３：１６５． ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ ｇｕｉｄｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］，Ｊ Ｔｒａｕｍａ，１９９９，４７（２）： ３０３～３０８． （收稿：２００１．１ １ ２７修回：２００１—０２．１８） 函 尊敬的医生： 国圃国盆国口圈值 您好！我们是北京兰德尔医疗器械有限责任公司。我公司全权负－Ｉｔ中珐合资北京蒙太 因医疗器械有Ｆ艮公司生产的人工关节在国内的销售及服务。现面向全国诚征经销商。如您惠寄 自己名片及所推荐经销商的名片， 正式授权经销商，我们将带给您一 北京兰德尔医疗器械有限责任公司 地址：北京吕平高科技园区白浮泉路２１号富泉花园１９号 椰锍．１０２２００ Ｉ ：０ １ Ｏ－６９７００『５０７ ６９７２５４０２ ６９７０４５０４ 美礼品。如您所推荐的经销商成Ｃｏ我公司 免费也衍：８００．８１０－０７２９ 传真：０１０．８９７０３２７４
