食品与发酵科技 Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第４９卷（第５期）Ｖｏ１．４９，Ｎｏ．５ 一种简易的尿激酶活性测定方法 李岩 （邢台医学高等专科学校基础部，河北邢台０５４０００） 摘 要：本研究改良了溶栓酶筛选采用的平板法，建立了一种新的尿激酶活性测定方法。该方法以琼脂糖为载体．纤 维蛋白原经凝血酶激活后转变为纤维蛋白形成凝块，再经尿激酶作用使其溶解，形成透明圈，透明圈的面积与尿激酶 的活性大小呈正相关。与《药典》中使用的气泡法测定尿激酶活性相比该方法成本低、操作简单、重复性好。 关键词：尿激酶；活性测定；平板法；气泡法 中图分类号：ＴＳ２０７．４ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７４—５０６Ｘ（２０１３）０５—００９１—０００３ Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ＬＩ Ｙａｌｌ （Ｘｉｎｇｔａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｘｉｎｇｔａｉ Ｈｅｂｅｉ ０５４０００，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｐｌａｔｅ ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ａｇａｒｏｓｅ ａｓ ｃａｒｒｉｅｒ，ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ ｉｎｔｏ ｆｉｂｒｉｎ ｃｌｏｔｓ ｂｙ ｔｈｒｏｍｂｉｎ， ｔｈｅｎ ｄｉｓｓｏｌｖｅ ｉｔ ｂｙ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ，ｆｏｒｍｉｎｇ ａ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ ｃｉｒｃｌｅ，ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ ｃｉｒｃｌｅ ｓｉｚｅ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｂｕｂｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ｈａｓ ｔｈｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙ ｏｆ ｌｏｗ ｃｏｓｔ，ｓｉｍｐｌｅ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ，ｇｏｏｄ ｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｕｒｏｋｉｎａｓｅ；ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ；ｐｌａｔｅ；ｂｕｂｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｄｏｉ：１０．３９６９０．ｉｓｓｎ．１６７４—５０６Ｘ．２０１３．０５—０２３ 尿激酶是一种具有激活纤溶酶原转变为纤溶酶 进而产生纤维蛋白溶解作用的蛋白水解酶。作为有 效的抗血栓药物在Ｉ临床上有着广泛的应用Ｅｌｉ。目前， 工业上主要从成年男性的尿液中提取，尿激酶活性 测定成为生产中的重要环节。而尿激酶活性的测定 方法主要采用国家药典中的“气泡法”：一种是类似 体内溶栓反应的生物测定法。但该方法存在着成本 高、操作繁琐、重复性差等特点，难于操作。本研究对 目前溶栓酶筛选所采用的“平板法”进行改良．创建 牛纤维蛋白原（凝蛋白８３ｍｇ／支）、牛凝血酶 （５０ＢＰ单位／支）、牛纤维蛋白溶酶原（８酪蛋白单位／ 支）、尿激酶标准品（８００ＩＵ／支）购自中国药品生物制 品检定所；尿激酶粗品购自北京唯美生物技术公司； 纤维蛋白原（１ＯＯｍ＃支）、凝血酶均购自于Ｓｉｇｍａ公 司。 １．２ 方法 １．２．１气泡法 试剂溶液的配制及供试品效价的测定按《中国 了一种成本低、操作简单、重复性好的尿激酶活性测 定方法［ 。 １材料和方法 １．１ 材料 收稿日期：２０１３—０４—２３ 药典））２０１０年版二部尿激酶效价测定法进行＿３＿．结果 如下式计算： 尿激酶效价＝（供试品单位数每毫升单位数×稀 释倍数）／取样量 作者简介：李岩（１９８０－），女，硕士。从事生物化学与分子生物学研究及化学教学。 第４９卷（总第１７７期） 李岩：一种简易的尿激酶活性测定方法 ９３ 于精确测量。而平板法以琼脂糖为载体，纤维蛋白 －Ｊ 原经凝血酶激活后转变为纤维蛋白形成凝块，再经 Ｅ ● 尿激酶作用使其溶解，形成透明圈，透明圈的面积 蚺 与尿激酶的活性大小呈正相关。该方法和气泡法一 瞎 样直观明了，是一种成本低、操作简单、重复性好尿 激酶活性测定方法．但该方法测量透明圈直径会人 为产生误差。此外平板法的琼脂糖及纤维蛋白原用 透明圈面积／ｍｍ 量经正交试验分析。更加降低了该方法的尿激酶测 量成本。经过采用两种方法对尿激酶粗品的活性检 图３平板法尿激酶标准曲线 Ｆｉｇ．３ Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｆｉｂｒｉｎ ｐｌａｔｅ 测比较发现，气泡法与平板法测量结果误差稳定， 经过修正即可得到准确结果，因此该方法值得推广 ２．４平板法和气泡法测定尿激酶活性的比较 应用 分别以平板法和《药典》中的气泡法经各自的 标准曲线对尿激酶粗品进行活性测定，结果见表 参考文献 ２，二者的误差均在６％左右，因此可通过对平板法 ［１］Ｇｏｌｄ Ｍ Ａ，Ｂｒａｄｙ Ｗ Ｅ，Ｌａｎｋｅｓ Ｈ Ａ，ｅｔ ａ１．Ａ ｐｈａｓｅ 的测定结果进行修正，即可通过简单方法得到准确 ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ （Ａ６）ｉｎ ｔｈｅ 结果。 ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｏｒ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｏｖａｒｉａｎ， ｆａｌｌｏｐｉａｎ ｔｕｂｅ，ｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ Ｇｙ— 表２平板法和气泡法测定尿激酶活性结果比较 ｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ ｓｔｕｄｙ［Ｊ］．Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ， Ｔａｂ．２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｕｒｏｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｂｙ ２０１２，１２５（３）：６３５－６３９． ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｂｕｂｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ［２］谢平会，董锐，薛成玉，等．纤维蛋白平板法测定保健食 品中纳豆激酶活力［Ｊ］．中国卫生检验杂志，２０１０，２０（７）： １６５８—１６５９． ［３］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典［Ｍ］．２０１０版．北 京：中国医药科技出版社，２０１０：３８０—３８２． ［４］杨明俊，杨晓彤，冯慧琴，等．两种纳豆激酶活性测定方 法对比及相关性分析［Ｊ］．食品研究与开发，２００８，２９（２）： ３结论 １３７－１４０． ［５］ 杨明，董超，史延茂，等．纤维蛋白平板法测定纳豆激酶 气泡法是我国《药典》推荐使用的尿激酶活性测 方法的改进［Ｊ］．中国酿造，２００８（７）：７７—８０． 定方法，但该方法气泡的形成及深度难于控制，因此 ［６］ Ｗａｎｇ Ｃ Ｔ，Ｊｉ Ｂ Ｐ，Ｌｉ Ｂ，ｅｔ ａ１．Ｐｕｒｉｉｆｃａｔｉｏｎ ａｎｄ 测量难度较大，测量过程中需使用牛纤维蛋白原、牛 ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ 凝血酶、牛纤维蛋白溶酶原等蛋白及酶制剂，且用量 ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＤＣ３３，ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｄｏｕｃｈｉ 较大，因此测量费用较高，但该方法精确度高，适用 ［Ｊ］．Ｊｌｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００６，３３（９）：７５０—７５８． （上接第５９页）ＮＫＡ一且等等。由于被吸附物质的 后，吸附量明显下降，需再生后使用。 性质有所不同．须考察上样液的ｐＨ值及上样液浓 度．上样液浓度不宜过低，否则会影响试验结果。树 参考文献 脂的选择取决于其综合性能，对其评价要从吸附 ［１］ 陈勇，惠腾恩，等．洋葱皮萃取物中黄酮类化合物的分析 量、解吸率和吸附动力学实验的结果综合考虑。 研究［Ｊ］．中国食品添加剂，１９９７（１）：１２４． 由树脂的吸附动力学曲线，可以很清楚的看到 ［２］张静泽，颜艳．吸附树脂分离技术在中药研究中的应 树脂虽然在２０ｈ才吸附饱和，但是在ｌＯｈ的时候．即 用［Ｊ］．中国中药杂志，２００４，２９（７）：６２８—６３０． ［３］ 郭丽冰，王蕾．常用大孔吸附树脂的主要参数和应用情 达到了饱和吸附量的８０％以上，吸附速度较快。适 况［Ｊ］．中国现代中药，２００６，８（４）：２６—３２． 宜于黄酮等功能成分的提取纯化。 ［４］ 卢艳花．中药有效成分提取分离技术［Ｍ］．北京：化学工 从重复使用次数上可知．树脂在重复使用５次 业出版社．２００５．
