维普资讯 http://www.cqvip.com 药学学报Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ２００７，４２（９）：９３５—９４２ ・９３５・ 左旋黄皮酰胺对冈田酸和 淀粉样肽２ 神经毒性的保护作用 张 静，程 勇，张均田 （中国医学科学院、中国协和医科大学药物研究所，北京１０００５０） 摘要：探讨左旋黄皮酰胺对冈田酸（ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ，ＯＡ）诱导的人神经瘤细胞（ＳＨ—ＳＹ５Ｙ）和去卵巢（ｏｖａｒｉｅｅｔｏｍｙ， ＯＶＸ）及单侧侧脑室注射ｉ／３ 所致神经元损伤的保护作用。通过ＭＴＴ试验、ＬＤＨ释放测定试验、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８荧 光染色试验以及ＳＨ—ＳＹ５Ｙ细胞检测，考察左旋黄皮酰胺拮抗冈田酸诱导的细胞毒作用。通过避暗试验、电镜检测、 Ｎｉｓｓｌ体染色及ＨＥ染色，考察左旋黄皮酰胺对去卵巢及侧脑室注射ｉ／３ ， 大鼠神经元的保护作用。左旋黄皮酰胺 可明显拮抗冈田酸诱导的细胞毒作用，提高去卵巢及侧脑室注射ｉ／３ ， 大鼠的学习记忆能力，保护海马及皮层神经 元。左旋黄皮酰胺可拮抗冈田酸及ｉ／３ 诱导的神经毒性，具有神经保护作用。 关键词：左旋黄皮酰胺；阿尔茨海默病；冈田酸；卢淀粉样肽 ， ；神经保护作用 中图分类号：Ｒ２８２．７１；Ｒ９６４ 文献标识码：Ａ 文章编号：０５１３—４８７０（２００７）０９—０９３５—０８ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ（一）ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ａｇａｉｎｓｔ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ・ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ２５＿３５ ＺＨＡＮＧ Ｊｉｎｇ，ＣＨＥＮＧ Ｙｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｊｕｎ—ｔｉａｎ （Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｆｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｐｅｋｉｎｇ Ｕｎｉｏｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＢｅＯｉｎｇ １０００５０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｉｓ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ（一）ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ＳＨ—ＳＹ５ Ｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ，ａｎｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ卢一ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ２５埘（ ２５埘）ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ ｉｎ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ（ＯＶＸ）ｒａｔｓ．ＭＴＴ ａｓｓａｙ，ＬＤＨ ａｓｓａｙ，ａｎｄ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ（一）ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ｏｎ ｔｈｅ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ＳＨ—ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ．Ｔｈｅ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｉｚｅｄ ａｎｄ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａ ２５－３５ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｌｅ ｏｆ ｒａｔｓ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ（一）ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ｏｎ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｓｔｅｐ—ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｅｓｔ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，Ｎｉｓｓｌ ｂｏｄｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ａｎｄ ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘａｍｉｎｅ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ ｎｅｕｒｏｎｓ．Ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ（一）ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ａｎｄ ＬｉＣ１ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｆｒｏｍ ＭＴＴ，ＬＤＨ ｒｅｌｅａｓｅ，ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｆｒｏｍ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ ＳＨ—ＳＹ５Ｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ． Ｔｈｅ ｓｔｅｐ—ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｅｓｔｓ ｓｈｏｗｅｄ（一）ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｌｅａｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ．Ｔｈｅ Ｎｉｓｓｌ ｂｏｄｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎｄ ＨＥ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ａｌｓｏ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ （ 一） ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ｏｎ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｎｓ ｏｆ ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ ａｎｄ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｒｔｅｘ．（一）Ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ｈａｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ Ａ／３２５—３５． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：（一）ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ；Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ；卢一ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ２５埘； ｎｅｕｒｏＤｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ 阿尔茨海默病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＤ）是常 卢一淀粉样肽（卢一ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ２５删，Ａ卢２５－３５）的沉积 见的中枢神经系统退行性疾病，临床以记忆力减退、 形成老年斑，神经元纤维缠结（ｎｅｕｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ 认知障碍、人格改变为主要特征；其病理学特征是 ｔａｎｇｌｅｓ，ＮＦＴｓ）和特定脑区胆碱能神经元和突触的缺 失…。目前ＡＤ仍缺乏有效的治疗药物，寻找有效 收稿日期：２００６—１２－１３． 的ＡＤ治疗药物是当前神经药理学研究的热点领域 通讯作者Ｔｅｌ：８６—１０—６３１６５１７９， 之一。 Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｊｔ＠ｉｍｍ．ａｃ．ｃｎ 维普资讯 http://www.cqvip.com 药学学报Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ２００７，４２（９）：９３５—９４２ 左旋黄皮酰胺是从芸香科植物黄皮中分离出的 １ ｈ，加入终浓度为７５ ｎｍｏ］・Ｌ 的ＯＡ和相应浓度 药物共同作用细胞４８ ｈ。各组分别加入ＭＴＴ，终质 量浓度为０．５ ｇ・Ｌ～，继续培养４ ｈ后，加入 ＤＭＳＯ，在５７０ ｌｌｍ处测定吸收度值。 ＬＤＨ测定法 细胞处理及分组同“ＭＴＴ法”， 具有脑复康药效基团的化合物，其两个苯环周围均 为亲脂性基团，使左旋黄皮酰胺易通过血脑屏障，在 脑内有较多的积累，并易穿过细胞膜发挥作用。左 旋黄皮酰胺已在离体脑片上被证实具有增强大鼠海 马基础突触传递活动和ＬＴＰ的作用 。此外还能 促进胆碱神经发育，剂量依赖性地增加神经元内胆 碱乙酰转移酶的活性和蛋白含量 。本试验建立 试验结束后，取细胞培养基１０ Ｌ测定乳酸脱氢酶 活力，在ｐＨ值为１０时，乳酸基质在氧化性辅酶Ｉ存 在下经乳酸脱氢酶催化反应生成丙酮酸，生成的丙 细胞损伤模型和记忆障碍的动物模型，在体内水平 和体外水平考察黄皮酰胺的神经保护作用。 材料与方法 细胞株ＳＨ—ＳＹ５Ｙ人神经瘤细胞，由宣武医院 惠赠。 实验动物 雌性Ｓｐｒａｇｕｅ—Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）大鼠，４ 个月龄，体重２００～２５０ ｇ，由中国药品生物制品检定 所实验动物中心提供。 药物及试剂左旋黄皮酰胺由中国医学科学院 药物研究所药物化学研究室黄量教授课题组提供。 冈田酸（ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ，ＯＡ）、氯化锂（ＬｉＣ１）和Ａ ： 删 均为Ｓｉｇｍａ公司产品。ＤＭＥＭ—Ｆ 培养基为Ｇｉｂｃｏ公 司产品。Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８为ＩＣＮ公司产品。乳酸脱 氢酶（ＬＤＨ）检测试剂盒购自北京北化康泰临床试 剂有限公司。 凝聚态Ａ ： 埘的制备 在无菌条件下，将 Ａ卢： １ ｍｇ溶于生理盐水０．５ ｍＬ中，终浓度为 １．８８６ ｍｍｏ］・Ｌ一，密封后置于３７℃培养箱中１４４ ｈ。 药物的配制 细胞学试验中左旋黄皮酰胺以 ＤＭＳＯ配制成浓度为１ ｍｍｏ］・Ｌ 的储存液，使用时 使ＤＭＳＯ含量终体积分数低于０．１％（ｖ／ｖ）。氯化 锂用无菌生理盐水配制为１ ｍｏｌ・Ｌ 的储存液。 ＯＡ以ＤＭＳＯ溶解为１×１０一ｔｏｏｌ・Ｌ。。的储存液。 动物试验中左旋黄皮酰胺以Ｔｗｅｅｎ一８０乳化配制成 乳浊液，其中Ｔｗｅｅｎ一８０的体积分数控制为０．５％ （ｖ／ｖ）以下。 ＭＴＴ法将ＳＨ—ＳＹ５Ｙ细胞接种在９６孔板，每 孔的细胞数为４ ０００／１００ ＩｘＬ，２４ ｈ细胞贴壁后，进 行分组处理。对照组：不加任何处理因素；模型 组：７５ ｎｍｏ］・Ｌ ＯＡ处理４８ ｈ；ＬｉＣ１组：１和１０ ｍｍｏ］・Ｌ ＬｉＣ１预处理ＳＨ—ＳＹ５Ｙ细胞１ ｈ以后，加 入终浓度为７５ ｎｍｏｌ・Ｌ 的０Ａ和相应浓度药物共 同作用细胞４８ ｈ；左旋黄皮酰胺组：左旋黄皮酰胺 （１×１０～，１×１０ 及１×１０～ｍｏｌ・Ｌ ）预处理 酮酸再与２，４－二硝基苯肼反应生成棕色的丙酮酸 二硝基苯肼。通过比色法测定丙酮酸含量，并推算 出乳酸脱氢酶的活力。 Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８染色 细胞处理及分组同“ＭＴＴ 法”，试验结束后，悬浮细胞，将Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８加入 培养的细胞中，终质量浓度为１０ ｇ・ｍＬ～，３７℃ 孵育３０ ｍｉｎ，１ ０００ ｒ・ｍｉｎ 离心５ ｍｉｎ去上清液，将 细胞残液混匀，取ｌ０ Ｌ放在玻片上，加盖玻片后荧 光显微镜下观察。 避暗试验及形态学观察对大鼠进行卵巢切除 手术，术后１个月按照体重随机分为６组，即假手术 组，拟ＡＤ模型组，氯化锂组（６０ ｍｇ・ｋｇ ），左旋黄 皮酰胺５，１０及１５ ｍｇ・ｋｇ 组，每组１６只动物，灌 胃给药４个月后，进行侧脑室 注射。手术 时，动物以水合氯醛（３５０ ｍｇ・ｋｇ。。）进行麻醉，将 动物固定在脑立体定位仪上，７５％酒精头皮消毒后 沿正中线开口，剥离皮下组织及骨膜，用３％过氧化 氢消毒手术野，参照Ｐａｘｉｎｏｓ等 的大鼠立体定位 图谱，以前囟为参照点，在大鼠颅骨上Ａ：一０．８， Ｌ：１．６，Ｖ：４．０侧脑室位置，用微量进样器缓慢注 入１．８８６ ｍｍｏ｜・Ｌ Ａ卢２５＿３５ ５ Ｌ，留针５ ｍｉｎ，假手 术组注射相同体积的生理盐水。手术１０ ｄ后进行 避暗试验。首次试验前，动物在试验箱中适应３ ｍｉｎ后，开启电源，将大鼠背向洞口放人明室，动 物通过洞口进入暗室受到电击后取出，２４ ｈ后重 做，记录动物５ ｍｉｎ内首次遭受电击时间即潜伏期 和遭受电击次数即错误次数，检测动物的被动学习 记忆能力。 避暗试验结束后，每组随机选３只大鼠用水合 氯醛（３５０ ｍｇ・ｋｇ ）麻醉，心脏灌注生理盐水约５０ ｍＬ用以冲去血管中的血液，待肝脏变白后灌注４％ 多聚甲醛（０．０１ ｍｍｏ］・Ｌ ＰＢＳ配制，ｐＨ ７．４）１００ ｍＬ，以动物身体僵硬为宜，立即取出脑组织。 电镜试验 取皮层部位制备电镜样品，做半薄 和超薄切片（厚度为１ ｍ及４０—６０ ｒｉｍ），半薄切片 作天青一美蓝染色光镜观察，超薄切片作电镜分析。 维普资讯 http://www.cqvip.com 张 静等：左旋黄皮酰胺对冈田酸和卢淀粉样肽 神经毒性的保护作用 Ｎｉｓｓｌ ｂｏｄｙ染色 所取脑组织用４％多聚甲醛 ４℃固定，经脱水、浸蜡、包埋后连续冠状石蜡切片， 切片厚度为８ ｍ，切片脱蜡至水，０．２％结晶紫染 色，室温３０ ｍｉｎ，蒸馏水洗，７０％乙醇分化，脱水至 蜡，中性树胶封片，观察。 ＨＥ染色所取脑组织４％多聚甲醛４℃固定， ０．０４ ０．０８ ０．１２ ＿工－ ｝ 露嚣 Ｔ ＿Ｉ＿ 幸宰 经脱水、浸蜡、包埋后连续冠状石蜡切片，切片厚度 为８ ｍ，切片脱蜡至水，苏木素６ ｍｉｎ，盐酸溶液分 广］ 撼嚣黼凇 寓 肉 囱 化，蒸馏水洗，７０％乙醇１０ ｍｉｎ，自来水冲洗１０ ｍｉｎ， ９０％乙醇１０ ｍｉｎ，蒸馏水洗，７０％乙醇１０ ｍｉｎ－－－￣８０％ Ｆｉｇｕｒｅ ２ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ（一）ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ｏｎ ＬＤＨ 乙醇１０ ｍｉｎ－－－￣８０％乙醇配０．５％伊红１０ ｍｉｎ，１００％ ｒｅｌｅａｓｅ．Ｌａｎｅ １：Ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｌａｎｅ ２：ＯＡ（７５ ｎｍｏｌ・ 乙醇２０ ｍｉｎ，二甲苯２０ ｍｉｎ，中性树胶封片。 Ｌ ）；Ｌａｎｅ ３：ＬｉＣｌ（１ ｍｍｏｌ・Ｌ ）；Ｌａｎｅ ４：ＬｉＣｌ 统计学处理 所有数据以 ±ｓ表示，ＭＴＴ和 （１０ ｍｍｏｌ・Ｌ ）；Ｌａｎｅ ５—７：（一）Ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ＬＤＨ试验采用ｔ检验，使用ＳＰＳＳ １１．５软件包进行 （１×１０一 ，１×１０一 ，ａｎｄ １×１０一。ｍｏｌ・Ｌ一 ）．ｎ＝ 分析。 ９． 尸＜０．０５， 尸＜０．０１ ＯＡ ｇｒｏｕｐ（２）； 尸＜ ０．０５ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（１） 结果 １ 左旋黄皮酰胺对ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞存活率的影响 ３左旋黄皮酰胺对ｏＡ所致ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞凋亡 用ＭＴＴ法检测，左旋黄皮酰胺预处理ＳＨ—ＳＹ５Ｙ 的影响 细胞１ ｈ以后，在左旋黄皮酰胺和ＯＡ共同培养４８ ｈ ＳＨ．ＳＹ５Ｙ细胞在左旋黄皮酰胺和ＯＡ共同孵育 的条件下，左旋黄皮酰胺可显著提高ＳＨ—ＳＹ５Ｙ细胞 ４８ ｈ以后，Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８染色试验结果见图３。结 的存活率（图１）。 果显示，正常细胞核均匀着色；ＯＡ处理后细胞核着 色不均匀，荧光增强，染色质聚集，核发生裂解。提 ｌ＿６ 示ＯＡ诱导了神经细胞的凋亡样损伤，这种损伤可 ｌ＿２ 能参与了ＯＡ诱导的神经退行性变。 ４左旋黄皮酰胺对侧脑室注射Ａ ： 埔大鼠学习记 ０．８ 忆的影响 ０．４ 在避暗试验中，拟ＡＤ模型组与假手术相比，第 ０ １次遭受电击的时间（即潜伏期）显著缩短，５ ｍｉｎ内 遭受电击的次数增加，并有显著性差异（Ｐ＜０．０５）； Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ（一）ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ｏｎ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ 左旋黄皮酰胺１０ ｍｇ・ｋｇ 组与拟ＡＤ模型组相比 ＳＨ—ＳＹ５ Ｙ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｗａｓ ａｓｓｅｓｓｅｄ ｂｙ ＭＴＴ 亦有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。见表１。 ａｓｓａｙ．Ｌａｎｅ １：Ｃｏｎｔｒｏｌ；Ｌａｎｅ ２：ＯＡ（７５ ｎｍｏｌ・ Ｌ ）；Ｌａｎｅ ３：ＬｉＣｌ（１ ｍｍｏ１．Ｌ ）；Ｌａｎｅ ４：ＬｉＣｌ Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ（一）ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ｏｎ ｔｈｅ ｌａｔｅｎｃｙ （１０ ｍｍｏｌ・Ｌ ）；Ｌａｎｅ ５—７：（一）Ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ａｎｄ ｅｒｒｏｒ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ＯＶＸ ａｎｄ Ａ ２５＿３５ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｒａｔｓ ｉｎ （１×１０一。。１×１０一 。ａｎｄ １×１０一 ｍｏｌ・Ｌ一 ）．ｎ＝ ｓｔｅｐ—ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｅｓｔ ９． 尸＜０．０５， 尸＜０．０１ ＯＡ ｇｒｏｕｐ（２）； 尸＜ ０．０５ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ（１） ２左旋黄皮酰胺对ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞ＬＤＨ释放的影 响 用ＬＤＨ法检测，左旋黄皮酰胺预处理ＳＨ．ＳＹ５Ｙ 细胞１ ｈ以后，在左旋黄皮酰胺和ＯＡ共同培养４８ ｈ 的条件下，左旋黄皮酰胺可显著降低ＳＨ—ＳＹ５Ｙ细 面±ｓ． Ｐ＜０．０５ ｆｆ￥ＡＤ ｍｏｄｅｌ ｇｒｏｕｐ： Ｐ＜０．０５ ｆｆ￥ｓｈａｍ 胞的ＬＤＨ活力（图２）。 ｇｒｏｕｐ 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 维普资讯 http://www.cqvip.com 张静等：左旋黄皮酰胺对冈田酸和Ｊ８淀粉样肽 神经毒性的保护作用 处于相对较高水平，促使神经元微管相关蛋白 （ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＡＰ）ｔａｕ过度磷酸 化，诱发神经元纤维缠结，导致轴突和胞体之间物质 和能量运输障碍，神经元发生退行性变。磷酸酯酶 分为ＰＰ一２Ａ、ＰＰ一２Ｂ、ＰＰ．２Ｃ和ＰＰ一１，其中ＰＰ一２Ａ对 ＡＤ过度磷酸化ｔａｕ蛋白的生物学活性恢复能力最 强 。冈田酸（ｏｋａｄａｉｃ ａｃｉｄ，ＯＡ）是Ｈａｌｉｃｈｏｎｄｒｉａ 挥药物作用。Ｃｈｕａｎｇ 报道，１ ｍｍｏ｜・Ｌ ＬｉＣ１可 达到拮抗谷氨酸神经毒性最佳作用的效果， Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｗＴ等… 报道ＬｉＣ１血药浓度在０．８～１．２ ｍｍｏ｜・Ｌ 可发挥作用，ＬｉＣ１对ＧＳＫ．３的Ｉｃ∞值在 １～２ ｍｍｏ｜・Ｌ 左右，综合以上文献，并考虑避免 ＬｉＣ１对动物的肾毒性，选定ＬｉＣ１的剂量为６０ ｍｇ・ ｋｇ～，在这一水平，既可达到有效血药浓度，又可避 ｏｋａｄａｅ提取的聚醚类单羧酸化合物（ｃ Ｈ Ｏ ），为 免肾毒性对动物造成严重损伤。在给药期间虽然发 蛋白磷酸酶ＰＰ一２Ａ和ＰＰ一１的抑制剂，但不抑制ＰＰ一 ２Ｃ。正常细胞内的磷酸酯酶和磷酸激酶处于动态 平衡，ＯＡ通过抑制磷酸酯酶使磷酸激酶处于相对 高活性状态，从而使蛋白质磷酸化程度增加。 本研究采用ＯＡ处理ＳＨ—ＳＹ５Ｙ细胞，建立蛋白 磷酸酯酶缺陷的阿尔茨海默样细胞模型。发现左旋 黄皮酰胺可抑制ＯＡ诱导的细胞活性降低，ＬＤＨ活 性增高以及出现凋亡特征。试验中采用的ＯＡ浓度 为７５ ｎｍｏｌ・Ｌ～，高于文献报道的诱导细胞损伤的 浓度１５～５０ ｎｍｏｌ・Ｌ～，可能是由于所用细胞株对 ＯＡ损伤不敏感，胞膜对药物通透性低，或细胞内存 在与药物结合的蛋白有关。较低浓度的左旋黄皮酰 胺和ＬｉＣ１可以抑制由ＯＡ诱发的细胞毒作用，表现 为维持琥珀酸脱氢酶的活力及减少ＬＤＨ的释放量， 说明药物可保持线粒体的活性，维持胞膜的完整性。 ＯＡ诱导的神经退行性变的机制可能为：ＯＡ致ｔａｕ 蛋白形成神经元纤维缠结后破坏轴浆转运；同时 ＯＡ为ＰＰ．２Ａ的特异性抑制剂，而ＰＰ．２Ａ的３个调 节亚单位中的Ｒ５／Ｂ５６具有强烈的抗凋亡作用，当 ＰＰ一２Ａ被抑制后通过ｃａｓｐａｓｅ一３介导出现了细胞凋 亡。 研究表明，ＬｉＣ１可通过多种途径发挥神经保护 作用 ’ 。ＬｉＣ１是糖原合成激酶．３（ＧＳＫ．３）的特异 非竞争性抑制剂，Ｉｃ∞值在１～２ ｍｍｏ｜・Ｌ～，ＬｉＣ１可 通过抑制ＧＳＫ．３的活性，抑制ｔａｕ蛋白磷酸化 …。 ＧＳＫ一３作为Ｗｎｔ信号通路的下游成分调节 一连环 蛋白（口．ｃａｔｉｎｉｎ）的稳定性、核转位以及转录活性，进 而影响突触的发生和神经元的存活¨ 。此外ＧＳＫ一 ３是细胞存活途径ＰＩ一３Ｋ／Ａｋｔ的下游成分，该通路 的激活会促使Ａｋｔ活性升高，使ＧＳＫ．３ 的９位丝氨 酸磷酸化并抑制其活性 。ＧＳＫ一３被认为是ＡＤ病 理发生的一个关键激酶，并命名为ｔａｕ蛋白激酶．１ （ＴＰＫ－１），促使ｔａｕ蛋白发生过度磷酸化、微管解聚、 神经元死亡 。ＬｉＣ１的作用通常需要长时间给 药才能显现，这就提示ＬｉＣ１通过影响基因表达发挥 药效，因此本研究采用ＬｉＣ１给药４个月，以充分发 现动物有多尿现象，但状态良好，并无死亡现象。 动物试验的模型是卵巢切除（ｏｖａｒｉｅｃｔｏｍｙ， ＯＶＸ）后，侧脑室注射 ： ，这是建立ＡＤ模型的 探索性试验。Ｊａｖｉａｒ报道聚积的 是诱发ｔａｕ 蛋白过度磷酸化的关键因素，进而引起神经元的退 行性变化， ： 在体外试验证明能够诱导ｔａｕ蛋 白的过度磷酸化 ’ ’ ，因此本研究采用侧脑室注 射 ： 的方法，在体内水平诱发ＮＦＴ。Ｓｉｍｐｋｉｎｓ 等 报道，ｓＤ大鼠卵巢切除后，其主动回避行为下 降，空间学习获得能力正常，但缺乏空间记忆能力， 补充雌激素明显改善上述异常。Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈ等 报道雌激素通过受体非依赖方式，并激活相关的细 胞信号通路，如ＰＩ．３Ｋ／Ａｋｔ通路或ＭＡＰＫ通路，使 ＡＰＰ的剪切方式由 一分泌酶和 一分泌酶来完成，从 而减少Ａ口的生成。为使雌激素充分耗竭，在实施 ＯＶＸ手术１个月后开始给药，同时采取侧脑室注射 ： 的方法，给药达４个月后再进行行为学试验， 排除雌激素的神经保护作用，以得到较佳的神经元 损伤和记忆障碍的动物模型。动物试验中，左旋黄 皮酰胺的剂量选定在５，１０及１５ ｍｇ・ｋｇ～，最高剂 量没有选定在２０ ｍｇ・ｋｇ。。是因为受试药物在一个 较小的范围内符合量效关系，剂量较大不能发挥更 佳的作用。 本研究从细胞和动物整体水平证明左旋黄皮酰 胺对Ａｐ： 和卵巢切除造成的神经元损伤模型有 明显的保护作用，对其造成的记忆障碍也有改善作 用，对ＡＤ的防治具有潜在的应用前景。 Ｒｅｒｅｒｅｎｃｅｓ ［１］Ｓｅｌｋｏｅ ＤＪ．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’Ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｎ，１９９１，６：４８７—４９８． ［２］Ｔａｎｇ Ｋ，Ｚｈａｎｇ ＪＴ．（一）Ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｌｏｎｇ ｔｅｒｍ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ａｎｄ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｌ Ｒｅｖ，２００３，２５：７１３—７１７． ［３］Ｄｕａｎ ＷＺ，Ｚｈａｎｇ ＪＴ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ（一），（＋） ｃｌａｕｓｅｎａｍｉｄｅ ｔｏ ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ ［Ｊ］． Ｃｈｉｎ Ｊ 维普资讯 http://www.cqvip.com ・９４２・ 药学学报Ａｅｔａ Ｐｈａｒｍａｅｅｕｔｉｅａ Ｓｉｎｉｅａ ２００７，４２（９）：９３５—９４２ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ。１９９８，１２：１６—１９． ［４］Ｐａｘｉｎｏｓ Ｇ。Ｗａｔｓｏｎ Ｃ．Ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｉｎ ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ［Ｍ］．Ａｕｓｔｒａｌｉａ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８６：２１． ［５］～Ｔａｎａｋａ Ｔ，Ｚｈｏｎｇ Ｊ，Ｉｑｂａｌ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｉｎ ＳＹ５ Ｙ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１９９８，４２６： ２４８—２５４． ［６］Ａｌｖａｒｅｚ Ｇ，Ｍｕｎｏｚ－Ｍｏｎｔａｎｏ ＪＲ，Ｓａｔｒｕｓｔｅｇｕｉ Ｊ，ｅｔ ａ１． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ 一ａｍｙｌｏｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｌｉｔｈｉｕｍ．Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｂｉｐｏｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄ，２００２，４：１５３—１６５． ［７］Ｇｏｎｇ ＣＸ，Ｌｉｄｓｋｙ Ｔ，Ｗｅｇｉｅｌ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｕ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ２Ａ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｉｆｂｒｉｌｌａｒｙ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２０００，２７５：５５３５—５５４４． ［８］ Ｃｈｕａｎｇ ＤＭ．Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｅｔｉｖｅ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｅ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｏｄ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ ｌｉｔｈｉｕｍ：ｃａｎ ｉｔ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｎｅｕｍｄｅｇｅｎｅｍｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ？［Ｊ］．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ， ２００４，１６：８３—９０． ［９］ Ｃｈｕａｎｇ ＤＭ，Ｃｈｅｎ ＲＷ，Ｃｈａｌｅｃｋａ—Ｆｒａｎａｓｚｅｋ Ｅ，ｅｔ ａ１． Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｔｈｉｕｍ ｉｎ ｃｕｈｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｐｏｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄ，２００２，４： １２９—１３６． ［１Ｏ］ Ｈｏｎｇ Ｍ，Ｃｈｅｎ ＤＣ，Ｋｌｅｉｎ ＰＳ，ｅｔ ａ１．Ｌｉｔｈｉｕｍ ｒｅｄｕｃｅｓ ｔａｕ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ一 ３［Ｊ］．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９７，２７２：２５３２６—２５３３２． ［１１】 Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ＷＴ，Ｈａｒｐｅｒ ＡＤ，Ｊ０ｖ６ Ｆ，ｅｔ ａ１．Ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ－３８ ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｉｆｃｉｅｎｃｙ ｍｉｍｉｃｓ ｔｈｅ ｂｅｈａｖｉｏｒａ１ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ １ｉｔｈｉｕｍ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２００４，２４：６７９１—６７９８． ［１２］Ｌｉｕ ＳＪ，Ｚｈａｎｇ ＡＨ，Ｌｉ ＨＬ，ｅｔ ａ１．Ｏｖｅｒａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ一３ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｏｌ一３ ｋｉｎａｓｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ａｎｄ ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ ｏｆ ｓｐａｔｉａｌ ｍｅｍｏｒｙ［Ｊ］．Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，２００３，８７：１３３３—１３４４． ［１３］Ｌｏｖｅｓｔｏｎｅ Ｓ，Ｈａｒｔｌｅｙ ＣＬ，Ｐｅａｒｃｅ Ｊ， ｅｔ ａ１． Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｕ ｂｙ ｇｌｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｋｉｎａｓｅ一３８ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ：ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｔｈｅ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，７３： １１４５—１１５７． ［１４］Ｐｈｉｅｌ ＣＪ，Ｗｉｌｓｏｎ ＣＡ，Ｌｅｅ ＶＭ，ｅｔ ａ１．ＧＳＫ－３ａ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｍｙｌｏｉｄ嵋ｐｅｐｔｉｄｅｓ ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００３，４２３：４３５—４３９． ［１５］Ａｌｖａｒｅｚ Ｇ，Ｍｕｎｏｚ—Ｍｏｎｔａｎｏ ＪＲ，Ｓａｔｒｕｓｔｅｇｕｉ Ｊ，ｅｔ ａ１． Ｌｉｔｈｉｕｍ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ８一ａｍｙｌｏｉｄ— ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ，１ ９９９，４５３： ２６０—２６４． ［１６］Ｚｅｎｇ ＹＱ，Ｃｈｅｎ ＸＣ，Ｚｈｕ ＹＧ，ｅｔ ａ１．Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂｌ ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ 卢一ａｍｙｌｏｉｄ ｐｅｐｔｉｄｅ２５—３５一ｉｎｄｕｃｅｄ ｔａｕ ｈｙｐｅｐｒｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｎｉｃａｌ ｎｅｕｒｏｎｓ［Ｊ］．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍ Ｓｉｎ（药学学报），２００５，４０：２２５—２３０： ［１７］Ｓｉｍｐｋｉｎｓ ＪＷ，Ｇｒｅｅｎ ＰＳ，Ｇｒｉｄｌｅｙ ＫＥ，ｅｔ ａ１．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｍｅｍｏｒｙ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｌｏｓｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ ｓ ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ，１９９７，１０３：１９Ｓ一２５Ｓ． ［１ ８］Ｇｏｏｄｅｎｏｕｇｈ Ｓ，Ｓｃｈｉｉｆｅｒ Ｍ，Ｂｅｈｌ Ｃ．Ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｉｎ ａ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ［Ｊ］．Ｊ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２００３，８４：３０１—３０５．
