(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 109517883 A(43)申请公布日 2019.03.26
(21)申请号 201811478424.3(22)申请日 2018.12.05
(71)申请人 广州市达信智能科技有限公司
地址 510600 广东省广州市南沙区丰泽路
106号（自编1号楼）X1301-E4508(72)发明人 李明 田溯宁 杨俊
(74)专利代理机构 南京正联知识产权代理有限
公司 32243
代理人 文雯(51)Int.Cl.
C12Q 1/6806(2018.01)A01N 1/02(2006.01)
权利要求书1页 说明书6页 附图2页
(54)发明名称
一种人粪便样本中脱落细胞的保存液(57)摘要
本发明涉及一种人粪便样本中脱落细胞的保存液，用来保存粪便样本中的脱落细胞，主要成分是EDTA、Tris、NaCl，其中EDTA是稳定剂，使保存液可在室温放置；Tris是缓冲剂，维持细胞
pH值；NaCl可维持电解质平衡，维持内外渗透压、
细胞渗透压。本保存液配比简单、成本低廉、使用方便。
CN 109517883 ACN 109517883 A
权 利 要 求 书
1/1页
1.一种人粪便样本中脱落细胞的保存液，其特征在于，包括：EDTA、Tris、NaCl和灭菌水。
2.根据权利要求1所述的人粪便样本中脱落细胞的保存液，其特征在于，所述的保存液按1L计，包括25-35g EDTA、55-65g Tris、0.2-0.8g NaCl。
3.根据权利要求1所述的人粪便样本中脱落细胞的保存液，其特征在于，所述的保存液按1L计，包括29.2g EDTA、60.55g Tris、0.58g Nacl。
4.根据权利要求1所述的人粪便样本中脱落细胞的保存液，其特征在于，所述的保存液的余量为灭菌水。
5.权利要求1-4任一所述的人粪便样本中脱落细胞的保存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
第1步，将EDTA用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水得到0.45-0.55mol/L的EDTA溶液，再用浓盐酸调pH至7.5-8.5；
第2步，将Tris 用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水得到0.9-1.1mol/L的Tris溶液；
第3步，将NaCl干粉用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水得到4.5-5.5mol/L的NaCl溶液；
第4步，按重量配比，加入EDTA溶液、Tris溶液、NaCl溶液充分混匀，调pH至6.5-7.5，再加灭菌水稀释；
第5步，分装。
6.权利要求1-4任一所述的保存液在用于人粪便样本脱落细胞保存中的用途。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的脱落细胞用于DNA检测。8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的DNA检测采用了基于PCR的方法。9.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的用途，包括如下步骤：将人粪便样本与保存液充分混匀，放入离心机中离心得到上清，取上清液。
10.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，在将样本与保存液混匀后，加入NaHCO3，并采用氮气对混匀液进行吹脱处理。
2
CN 109517883 A
说 明 书
一种人粪便样本中脱落细胞的保存液
1/6页
[0001]
技术领域
[0002]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人粪便样本中脱落细胞的保存液。
[0003]
背景技术
[0004]结直肠癌是当今最常见的疾病之一，每年全球有约 120 万名患者被确诊为结直肠癌，而有超过 60 万名患者直接或间接死于结直肠癌。其在各地区的发病率有显著差异，这与所谓其生活方式有密切联系。男性结直肠癌的发病率高于女性。此外，结直肠癌的发病率会随着年龄的增大而增加，比如发达国家的结直肠癌发病中位年龄为 70 岁。[0005]虽然遗传因素是结直肠癌的的危险因素，但大部分结直肠癌都是散发的，并在几年内以腺瘤 - 肿瘤的形式发生。当前结直肠癌最主要的治疗手段是外科手术、新辅助放射治疗（患者是直肠癌）以及辅助化疗（患者为 III、IV 期或高风险的 II 期结肠癌）。 在生存期方面，I 期患者的 5 年生存率可达 90% 以上，而 IV 期患者只有略大于 10% 的生存率。内镜或血液筛查已被证实能有效降低结直肠癌发病率和死亡率，但大部分国家仍未开始实施有组织的筛查。
[0006]现阶段运用高通量测序技术检测人基因突变，使肠癌的早期诊断得到了进一步的发展。通过血液和粪便两种途径均可得到人的基因，但是癌细胞直接脱落进入粪便比直接进入血液早，所以从粪便样本中提取脱落细胞DNA进行检测能较早预测结直肠癌的发生。粪便中的脱落细胞较少，若取样后保存不当，导致细胞裂解，最终DNA提取失败。本保存液可以常温保存粪便样本，应用于结直肠癌早期诊断、科学研究等多个领域。
[0007]
发明内容
[0008]本发明目提供一种人粪便中脱落细胞保存液及其制备方法，该保存液配比简单，成本低廉，使用方便。使用本保存液可以保存粪便样本，在常温下可以长时间保存。[0009]本发明的第一个方面，提供了：
一种人粪便样本中脱落细胞的保存液，包括：EDTA、Tris、NaCl和灭菌水。[0010]在一个实施方式中，所述的保存液按1L计，包括25-35g EDTA、55-65g Tris、0.2-0.8g NaCl。
[0011]在一个实施方式中，所述的保存液按1L计，包括29.2g EDTA、60.55g Tris、0.58g Nacl。
[0012]在一个实施方式中，所述的保存液的余量为灭菌水。[0013]本发明的第二个方面，提供了：
人粪便样本中脱落细胞的保存液的制备方法，包括如下步骤：第1步，将EDTA用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水得到0.45-0.55mol/L的EDTA溶
3
CN 109517883 A
说 明 书
2/6页
液，再用浓盐酸调pH至7.5-8.5；
第2步，将Tris 用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水得到0.9-1.1mol/L的Tris溶液；
第3步，将NaCl干粉用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水得到4.5-5.5mol/L的NaCl溶液；
第4步，按重量配比，加入EDTA溶液、Tris溶液、NaCl溶液充分混匀，调pH至6.5-7.5，再加灭菌水稀释；
第5步，分装。
[0014]本发明的第三个方面，提供了：
上述的保存液在用于人粪便样本脱落细胞保存中的用途。[0015]在一个实施方式中，所述的脱落细胞用于DNA检测。[0016]在一个实施方式中，所述的DNA检测采用了基于PCR的方法。[0017]在一个实施方式中，所述的用途，包括如下步骤：将人粪便样本与保存液充分混匀，放入离心机中离心得到上清，取上清液。[0018]在一个实施方式中，在将样本与保存液混匀后，加入NaHCO3，并采用氮气对混匀液进行吹脱处理。[0019]有益效果
本发明的一种人粪便中脱落细胞保存液及其制备方法，其有益效果在于配比简单、成本低廉、使用方便，使取样后的样本在运输、交接、提取前检测等过程中，在常温下能够长时间有效保存样本。在混合液中加入NaHCO3，在吹脱的过程中可以使样本中的H2S被吹脱气分离，提高了细胞保存质量。
[0020]
附图说明[0021]图1 显示荧光定量pcr扩增反应条件。[0022]图2 显示荧光定量的标准品荧光定量PCR扩增。[0023]图3是标准品的标准曲线。[0024]图4 是用本保存液保存提取DNA所得浓度的扩增曲线。
[0025]
具体实施方式[0026]实施例1
保存人粪便中细胞的保存液，其特征在于，在1L保存液中含有29.2g EDTA干粉、60.55g Tris干粉、0.58g NaCl干粉，余量为灭菌水。
[0027]所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：
1）将EDTA干粉29.2g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液，再用浓盐酸调pH至8。[0028]2）将Tris干粉60.55g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。
4
CN 109517883 A[0029]
说 明 书
3/6页
3）将2.92Nacl干粉倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至10ml得
到5mol/L的Nacl溶液。[0030]4）依次分别加入200ml EDTA溶液、500ml Tris溶液、2ml Nacl溶液充分混匀，调pH至7，再加灭菌水至1L。
[0031]往30mL取样管中加入15mL保存液，以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中，盖紧管盖，常温放置。将样本与保存液充分混匀，放入离心机中离心30min以上得到上清，取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA；再经化学法和酶法破碎细胞壁后，用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸（陈思媛, 郭明璋, 贺晓云, et al. 用于分子生物学检测的粪便DNA的提取方法优化[J]. 农业生物技术学报, 2013, 21(12):1509-1517.）。[0032]实施例2
保存人粪便中细胞的保存液，其特征在于，在1L保存液中含有25g EDTA干粉、65g Tris干粉、0.2g NaCl干粉，余量为灭菌水。
[0033]所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：
1）将EDTA干粉25g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液，再用浓盐酸调pH至8。[0034]2）将Tris干粉65g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。[0035]3）将1.01Nacl干粉倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至10ml得到5mol/L的Nacl溶液。[0036]4）依次分别加入200ml EDTA溶液、500ml Tris溶液、2ml Nacl溶液充分混匀，调pH至7，再加灭菌水至1L。
[0037]往30mL取样管中加入15mL保存液，以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中，盖紧管盖，常温放置。将样本与保存液充分混匀，放入离心机中离心30min以上得到上清，取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA；再经化学法和酶法破碎细胞壁后，用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸。[0038]实施例3
保存人粪便中细胞的保存液，其特征在于，在1L保存液中含有35g EDTA干粉、55g Tris干粉、0.8g NaCl干粉，余量为灭菌水。
[0039]所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：
1）将EDTA干粉35g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液，再用浓盐酸调pH至8。[0040]2）将Tris干粉55g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。[0041]3）将4.02Nacl干粉倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至10ml得到5mol/L的Nacl溶液。[0042]4）依次分别加入200ml EDTA溶液、500ml Tris溶液、2ml Nacl溶液充分混匀，调pH至7，再加灭菌水至1L。
[0043]往30mL取样管中加入15mL保存液，以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样
5
CN 109517883 A
说 明 书
4/6页
管中，盖紧管盖，常温放置。将样本与保存液充分混匀，放入离心机中离心30min以上得到上清，取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA；再经化学法和酶法破碎细胞壁后，用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸。[0044]实施例4
保存人粪便中细胞的保存液，其特征在于，在1L保存液中含有29.2g EDTA干粉、60.55g Tris干粉、0.58g NaCl干粉，余量为灭菌水。
[0045]所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：
1）将EDTA干粉29.2g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液，再用浓盐酸调pH至8。[0046]2）将Tris干粉60.55g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。[0047]3）将2.92Nacl干粉倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至10ml得到5mol/L的Nacl溶液。[0048]4）依次分别加入200ml EDTA溶液、500ml Tris溶液、2ml Nacl溶液充分混匀，调pH至7，再加灭菌水至1L。
[0049]往30mL取样管中加入15mL保存液，以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中，盖紧管盖，常温放置。将样本与保存液充分混匀，再在混合液中加入0.2gNaHCO3，并使用氮气进行吹脱处理10min，处理之后，将混合液放入离心机中离心30min以上得到上清，取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA；再经化学法和酶法破碎细胞壁后，用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸（陈思媛, 郭明璋, 贺晓云, et al. 用于分子生物学检测的粪便DNA的提取方法优化[J]. 农业生物技术学报, 2013, 21(12):1509-1517.）。[0050]对照例1
与实施例1的区别是：保存液中未加入EDTA干粉。[0051]保存人粪便中细胞的保存液，其特征在于，在1L保存液中含有60.55g Tris干粉、0.58g NaCl干粉，余量为灭菌水。
[0052]所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：
1）将Tris干粉60.55g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。[0053]2）将2.92Nacl干粉倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至10ml得到5mol/L的Nacl溶液。[0054]3）依次分别加入500ml Tris溶液、2ml Nacl溶液充分混匀，调pH至7，再加灭菌水至1L。
[0055]往30mL取样管中加入15mL保存液，以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中，盖紧管盖，常温放置。将样本与保存液充分混匀，放入离心机中离心30min以上得到上清，取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA；再经化学法和酶法破碎细胞壁后，用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸。[0056]对照例2
与实施例1的区别是：保存液中未加入Tris干粉。
6
CN 109517883 A[0057]
说 明 书
5/6页
保存人粪便中细胞的保存液，其特征在于，在1L保存液中含有29.2g EDTA干粉、
0.58g NaCl干粉，余量为灭菌水。
[0058]所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：
1）将EDTA干粉29.2g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液，再用浓盐酸调pH至8。[0059]2）将2.92Nacl干粉倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至10ml得到5mol/L的Nacl溶液。[0060]3）依次分别加入200ml EDTA溶液、2ml Nacl溶液充分混匀，调pH至7，再加灭菌水至1L。
[0061]往30mL取样管中加入15mL保存液，以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中，盖紧管盖，常温放置。将样本与保存液充分混匀，放入离心机中离心30min以上得到上清，取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA；再经化学法和酶法破碎细胞壁后，用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸。[0062]对照例3
与实施例1的区别是：保存液中未加入NaCl干粉。[0063]保存人粪便中细胞的保存液，其特征在于，在1L保存液中含有29.2g EDTA干粉、60.55g Tris干粉，余量为灭菌水。
[00]所述的一种人粪便中脱落细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：
1）将EDTA干粉29.2g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至200ml得到0.5mol/L的EDTA溶液，再用浓盐酸调pH至8。[0065]2）将Tris干粉60.55g倒入烧杯，用少量灭菌水溶解，溶解完全后加灭菌水至500ml得到1mol/L的Tris溶液。[0066]3）依次分别加入200ml EDTA溶液、500ml Tris溶液充分混匀，调pH至7，再加灭菌水至1L。
[0067]往30mL取样管中加入15mL保存液，以备使用。取样时需加入3-4g粪便样本到取样管中，盖紧管盖，常温放置。将样本与保存液充分混匀，放入离心机中离心30min以上得到上清，取上清液以备提取。使用DNA提取试剂盒提取粪便样本中脱落细胞的DNA；再经化学法和酶法破碎细胞壁后，用酚仿抽提法去除蛋白质获得核酸。
[0068]采用上述实施例1～4以及对照例1～3中得到的DNA样本，取1μl进行Qubit定量。[0069]表1 DNA样本定量结果
从上表中可以看出，采用本发明的方法可以获得纯度较好的DNA样本，而在对照例中的保存液存在着细胞发生降解的问题，使得A260/A280值升高，并且DNA提取量较低。而实施例4中采用了吹脱处理，可以有效地消除掉粪便中的H2S对样本的影响，可以提高DNA提取效果。
[0070]实时荧光定量pcr扩增及定量
1试剂准备
采用实施例1中的保存液得到的DNA样品，按比例混合pcr扩增反应体系的成分，充分混
7
CN 109517883 A
说 明 书
6/6页
匀后备用。[0071]2加样
向pcr反应管中加入pcr扩增反应体系20ul，再分别加入标准品5ul、待测样本5ul和无酶水5ul，盖紧管盖，放入仪器样品槽。[0072]3编辑（BIO-RAD CFX96）
打开仪器相应的软件，点击File新建扩增反应循环条件：94℃ 5分钟，94℃30秒，56℃ 30秒，4个循环，92℃ 30秒，62℃ 30秒，35个循环（见附图1），点击ok后保存。点击NEXT到plate setup，按对应顺序设置标准品、待测标本和无酶水，并在Name栏中设置样品名称。选中所有设置样品孔，点击select Fluorophores，选择ROX点击ok，回到之前的页面后再点击ok保存。点击NEXT到下一个页面，再点击start run运行。[0073]4检测结果，附图2、3、4。[0074]可以看出，采用本发明的方法得到的DNA样本可以适合于实时荧光定量PCR的方法。
8
CN 109517883 A
说 明 书 附 图
1/2页
图1
图2
9
CN 109517883 A
说 明 书 附 图
2/2页
图3
图4
10
