枸杞根腐病菌拮抗菌株的筛选与鉴定

发病严重的枸杞种植园中,采集健康枸杞植株根际土土,通过程规稀释分离法进行菌株分离；以枸杞根腐病 主要致病菌---腐皮镰抱菌(Fusarium solani')为供试菌，采用平板对峙法筛选腐皮镰抱菌的拮抗菌株，并通过形态学院分子生物学方法对拮抗菌株进行了种类鉴定。结果表明:在健康枸杞植株根际土壤样品中分离

获得的101株细菌、52株放线菌、30株霉菌和27株酵母菌中，筛选得到对枸杞根腐病菌具有抑制效果的菌株

HYMB9和HYCA,其中菌株HYMB9抑菌率为52. 29%，菌株HYC-7的抑菌率为39. 80% +经鉴定HYMN9

为中华根瘤菌(SiooUizobium sp. ) ,HYC-7为绿僵菌(Metarbizium sp.)。该研究结果可为有效利用土壤微生 物防治枸杞根腐病提供理论依据。关键词:枸杞;根腐病;拮抗菌株;筛选;鉴定中图分类号:S436. 639

文献标志码:A 文章编号:10043524(2020)05 3858 38Screening and identidcation of antagonistic straint of wolfferry root rotZHANG Xiaoyan, HE Jing** , HOU CaWiv, ZHANG Shuheng

(College of Forestry, Gocsp AgricuPurat Undersity, LaozOou 730070, China)Abstract: Wolfbeiry diseases and insect pests are important factors fectWa the development of wolfbeiry Wdustf,

among which the root mt of wolfbeiry W a common disease. In this study, healthy wolfbeiry rhizosphere soil sampler

were selected from seriously diseased wofberm plantations and strains were isolated by conventional dbution method.

Fusarium solani, the main pathogen of wolfbeiry root rot, war selected ar the tested strain by plate confrontation

method, and the antagonistic strain war identified by morphology and moleculas biology. The results showed that 101

strains of bacteria, 52 strains of actinomyceter, 30 strains of myceter and 27 strains of saccharomycetes were isolated

from rhizosphere soil sampler of healthy wolfberry. Two antagonistic strains, HYM-C9 and HYC-7, were screened and identified as Sinorhizobium sp. and Metarbizium sp. , respectively. The results provided a theoretical basis fos

the eVective use of soil microoryanWms to manage mot rot of wolfbeiry.Key words: wolfbeiry ； mot mt ； antagonistic bacteria ； screening ； identification枸杞(Lycium barbarum )属于茄科枸杞属落 叶木本多刺灌木,能承受-15 ~40 g的极端环境收稿日期：2019-1138基金项目甘肃草自然科学基金(17JJ5RA146)'甘肃农业大学青年导师扶持基金(GAU-BDFCA018-07)'甘肃农业大学学科建设专项基金(GAU-NKJS-2018 396)作者简介:张小彦(1994—)，女，甘肃临洮人，硕士研究生，研究方向为森林保护。E-mail：1039507106@qq. cm* 通信作者，何静,E-mail：hejine268@ aliyun. com张小彦，等.枸杞根腐病菌拮抗菌株的筛选与鉴定-859 -温度。枸杞属植物约有70种，分布于欧亚、 北美、南美、南非和澳大利亚的温带至亚热带的 不同区域［1-2］,在我国则主要分布在川北、华北 北部、内蒙古、陕西、甘肃、宁夏、青海和等

1材料与方法1.1材料位現枸杞的营养价值极高，且含有多种生物活

性化合物,如多糖、矿物质、类胡萝卜素和多酚类

1.1.1 供试菌株腐皮镰抱菌（FusaPum solant）,保存于甘肃

农业大学林学院实验室,菌种于PDA培养基试管

化合物，具有抗癌、减肥、抗衰老、抗糖尿病、抗肾 脏和肝脏疾病等多种益处⑷,因而被誉为“超级

斜面中生长,4 g低温冰箱中保存备用。1.1.2 培养基食品”，越来越受到人们的青睐%5& +近几年，甘肃省枸杞种植规模不断扩大，现

阶段枸杞栽培面积超过2万hm2 ,而枸杞病害的

发生也逐年加重，防控难度进一步加大［6］,其中

枸杞根腐病是最主要的病害之分。研究显示，

腐皮镰抱菌（FusaPum solani）常引起系统性病害 的发生［8_9］，是甘肃枸杞根腐病的主要致病菌之

分0&，病菌-般自伤口或表皮侵地⑴，使枸杞在

整个生育期内均可发病，且发病情况与气候条

件、灌水和栽培方式均有关系，一般情况下6月 中旬发病,盛期在7—8月%12&。发病时，患病植株 叶片发黄，枝条萎缩，造成枸杞品质下降，产量降

低，严重时导致全株枯死,给当地枸杞种植户带 来了极大的经济损失［13］ +目前，对枸杞根腐病的防治主要以化学药剂 为主。前人研究发现，噁霉•福美双酗&、代森

铵7&、咯菌菌等不同供试杀菌剂对枸杞根腐

病病菌菌丝生长均有明显的抑制效果。然而，化

学药剂的大量使用不但造成生产成本增加,最重 要的是引起耐药病原体的出现「“，且化学农

药会对环境和生态平衡产生不利影响,并通过生 物富集作用对人畜健康造成潜在威胁叫生防

菌因在改善土壤环境、控制病害中所表现出来的 效果好、成本低、效率高、环境友好和无药物残留 等特点，而日益受到关注叫叫 但受各种因素

的制约，尤其是外界环境对生防菌的活性影响，

导致防效稳定性不高。因而，获得防效稳定的生

防菌株，利用微生物对枸杞根腐病进行防治，显 得至关重要叫目前，利用根际拮抗菌防治枸

杞根腐病的研究还鲜有报道。本研究从健康枸

杞植株根际采取土样，从中分离、筛选对枸杞根 腐病菌F. solant -具拮抗作用的菌株，为有效利

用土壤微生物防治枸杞根腐病提供理论依据。拮抗菌株的分离以及供试菌种的纯化采用 PDA培养基和蛋白对琼脂培养基。1-2方法1.2.1

土样采集方法土壤采自甘肃省景泰县2年生枸杞种植园

中生长状态良好的健康枸杞根际。采用5点取 样法，铲去树体表层土,挖取地表下约10-15 cm

处的土壤，装入无菌自封袋，快速带回实验室置

于报纸上自然风干,备用。1.2.2

土壤微生物的分离纯化将自然风干后的土壤过20目筛，称取5 g置

于预先准备好的三角瓶中，加入45 mL无菌水及

适量玻璃珠，振荡20 min，得到土壤样品悬液，依

次用无菌水配置成3个浓度梯度的土壤悬液 （10'7、10\"、10\"）,每个梯度取100 !L均匀涂

布于PDA培养基的表面上，每组设置3个重复, 于25 g下培养3 ~5 d,挑取性状差异明显的单 菌落进行编号，划线法纯化培养［21-23］ +1.2.3

拮抗菌的筛选采用平板对峙法筛选拮抗菌株。先在PDA

平板上活化腐皮镰抱菌，用打孔器取5 mm的菌 饼置于培养基的一侧，距平板边缘3 cm处对称

接种已纯化的土壤微生物单株菌株，每个处理重

复3 ~5次,25 g培养,5 -7 d后观察其抑菌作

用。然后分别计算高活性拮抗菌株对腐皮镰菌

菌的抑制率。抑菌率=（对照组菌落直径-处理组菌落直 径）/（对照组菌落直径-菌饼直径））1100% +1.2.4 拮抗菌株的鉴定形态学观察:主要包括菌落的大小、颜色、菌

落的形态等方面。分子生物学鉴定:将原始菌扩大培养后利用 TIANGEN DNA KIE提取原始菌基因组DNA。或-860 -浙江农业学报 第32卷 第5期用移液器吸取少量菌落，加入适量的1%的sds

沸水煮10 mW（酵母在碱性条件下，高温度下其

从分离得到的101株细菌、52株放线菌、30

株霉菌和27株酵母菌中筛选得到2株对腐皮镰

抱菌具有明显抑制作用的菌株,分别为HYM19

细胞壁更容易破碎），吸入适量基因组DNA或破

碎产物,Toq酶,dNTP及反应所需的引物（该引物

为通用生物合成）：27F （5qBGAGTTTGATCCTG- GCTCAGN，）, 1492R

（图1A）和HYC7（图1A）,在PDA培养基上产

生明显的抑制带。2.3拮抗菌株对腐皮镰抱菌的抑制效果PDA平板对峙结果显示，菌株HYM19和菌

（ 5,-NACGGCTACCTTG-TACGACTTN - ； ITS1 （5 ^NCCGTAGGTGAACCT-

GCGGN -）,ITS4 （5ITCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'）进行PCR扩增实验。反应体系（总体系50

株HYC7对腐皮镰刀菌均有显著的拮抗效果，且

HYM19的抑菌率为52. 29% ,菌株HYC7的抑菌

!L）包括$26 !L MW酶包含（Taq酶1 叽 DNTP

10 !L, Buffer 15 ⑴，21 ! H20,1 叽 模板，1

!L FORWARD-WANGXUE 弓| 物，1 ^L RE-

VERSE-WANGXUE引物，然后进行测序实验，根

据所得到测序目的序列到NCBI进行Blast比对。

反应程序为96 g预变性3 mW；96 g变性30 -, 58 g退火30 r,72 g延伸1 mW,35个循环；72 g

终延伸10 mWo PCR反应结束后，1%的琼脂糖

鉴定,并使用Axygen凝胶回收试剂盒回收所需

PCR产物片段。2结果与分析2. 1根际土壤微生物的分离菌株数由表1可知，采集的土样计分离到101

株细菌、52株放线菌、30株霉菌和27株酵母菌。

其中，当根际土壤的浓度稀释为10 一7时,较于土

壤的浓度稀释为10 一8和10 -9,分离效果明显，分 离出的微生物种类偏多。2.2拮抗菌株的筛选表1不同根际土壤稀释浓度分离到的菌株数Table 1 Number of strains isolated from dWferent concentra­tions of rhizosphere soil sampler浓度细菌放线菌霉菌酵母菌ConcenteationBacteriaActinomycetvsMycetvs Saccharomycetvs10-715502117731 5610 _1236796001 195110#82

57105117610合计Total101523027率为39.80%,菌株HYM19的抑菌率 比菌株

HYC7的抑菌率高12. 49百分点（表2） +2. 4 拮抗菌株HYM19和HYC7形态学特征与

分子生物学鉴定细菌HYM19菌落（图2-A）呈花瓣状，表面

有褶皱突起、有黏液，湿润、黏稠、易挑取、质地均

匀，菌落正反面或边缘与部位颜色一致，边

缘一般看不到细胞，与培养基不结合，菌落外观

形态小而凸起，生长速度较慢。真菌HYC7（图2-

B）菌落初期出现白色绒毛状，培养至后期整个菌

落被绿色分生抱子覆盖;在光学显微镜下观察,

菌丝分支、有隔、无色光滑,分生抱子梗与菌丝近图1 HYM19(A)和HYC7(B)产生的抑菌带Fig.1 The bacteriostatic zone produced by HYM19 ( A ) and HYC7(B)表2拮抗菌株对腐皮镰刀菌的抑制效果Table 2 Inhibitom eVect of antagonistic strains on Fusofumsolool株编号处理组菌落直径抑菌率StrainColony diameter ofInhibitionnumbeecontrol group/mmrata/%对照 Control60.00 ±1.37 a—HYM1931.24±0. 74 c52.29HYC738. 11 ±1.39 b39.80同列数据后没有相同小写字母表示差异显著(P <0. 05) +The values in the sama column followed by dWferent letters showed the significant dWferenca ( P < 0. 05 ).张小彦，等.枸杞根腐病菌拮抗菌株的筛选与鉴定-861 -康土壤中分离的HYM19菌株和HYC7菌株与已

知模式属的最大相似性均在98%以上，说明新分

离内生菌的科学分类地位比较明确（图4、图5）。琼脂糖凝胶电泳（图6）显示,HYM19菌株的

its-ocr产物在1 000 bp附近处出现条带，测序

后得到其ITS序列长为1 359 bp。通过BLAST进 行序列比对,与中华根瘤菌属相似性最高，结合形

图2 HYM19(A)和HYC7(B)菌落形态Fig. 2 Strain morphology of HYM19(A) and HYC7( B)态学分析，鉴定其为中华根瘤菌属Sinorhizobivmo HYC7菌株的ITS-OCR产物在500 bp附近处出现条

似，在其末端产生瓶状单个或多个小梗;分生抱

带,测序后得到其ITS序列长为553 bp。通过

blast进行序列比对，与绿僵菌属相似性最高，结合

子呈念珠状,较对称（图3）。16S/NA基因序列比对结果显示，从枸杞健

形态学分析，鉴定其为绿僵菌属Metarpizium+标尺=20 |jLno Bars =20 jjin.图3 HYC7孢子形态(A)、菌丝形态(B)及产孑包梗和分生孢子(C)Fig. 3 Spore morphology ( A) $ mycelial morphology ( B) and conidiophores and conidia ( C) of HYC7IHYC-71 MH104861.1 Metarhizium anisopliae--------------KC355181.1 Metarhizium robertsii--------------KU847858.1 Metarhizium anisopliaeDQ421049.1 Uncultured--------------AJ6070.1 Metarhizium anisopliae--------KU983799.1 Metarhizium robertsii----------------MF667769.1 Metarhizium robertsii----------------------FJ58.1 Metarhizium anisopliae---------------------------------------AY635449.1 Metarhizium anisopliae var. anisopliae-----------MH859067.1 Metarhizium anisopliae------------MG844433.1 Metarhizium anisopliae--------JF792884.1 Metarhizium anisopliaeNR 132011.1 Metarhizium robertsii-----EU307906.1 Metarhizium anisopliaex/ar. anisopliae| LT220714.1 Metarhizium robertsiiI LT220712.1 Metarhizium robertsii-------EU307926.1 Metarhizium anisopliaevar. anisopliaeDQ421033.1 Uncultured---------HM055440.1 Metarhizium robertsii-------------------------------AB099941.1 Metarhizium anisopliae------------AY635457.1 Metarhizium anisopliae var. anisopliae5图4 菌株HYC7的系统发育树Fig. 4 Phylogenetic tree of strain HYC7-862 -浙江农业学报第32卷第5期______________IKY753211.1 Ensifer adhaerens_______ L DQ303316.1 Sinorhizobium sp.

MT065733.1 Ensifer adhaerens[KY753268.1 Ensifer adhaerensKU179352.1 Ensifer adhaerens| AY505137.1 Sinorhizobium sp.1 AF452129.1 Sinorhizobium morelense [MK382452.1 Ensifersp.MK382450.1 Ensifersp.EU193081.1 Un cultured EnsiferspMH613070.1 Sinorhizobium sp.AJ420776.1 Sinorhizobium morelenseAM181737.1 Sinorhizobium morelense-EU7697.1 Ensifer adhaerensLT9980.1 Sinorhizobium sp.AY559079.1 Sinorhizobium morelense---------------------HYM19AY505134.1 Sinorhizobium sp.

EF442029.1 Sinorhizobium sp.-------------------------------------MF581283.1 Sinorhizobium sp.------------------MK332555.1 Ensifer adhaerens-----------------------------------------KF358250.1 Ensifer adhaerens0.5图5 菌株HYM19的系统发育树Fig. 5 Phylogenetic tree of strain HYM19HYM19 HYC7产中的重要措施，而生防菌的筛选则是开展生防

病害的技术核心和关键%26&。具有生防活性的微

生物菌株筛选于自然界,对环境无污染残留,是

一种环境友好的生物防治新手段%27&。生防菌主

要通过分泌抗性物质、空间和营养竞争及诱导植

物产生抗病性的方式抑制植物病害，其中具有多 重作用方式的拮抗菌株在病害防治中具有更好

的应用潜力%28&。随着现代农业的高速发展,化

图6琼脂糖凝胶电泳图Fig. 6 Agar gel electrophoresis学肥料与农药的大量使用,使得土壤肥力显著下 降，环境质量与人类健康以及生态平衡受到极大

3 讨论与结论枸杞根腐病是一种危害极其严重的土传病

害严重时枝条或全株枯死,极具毁灭性%24&。随

威胁。充分利用各种可再生生物资源，是解决农 业生产与环境问题以及经济效益与环境代价之

间矛盾的根本途径。生物防治有助于改善土壤 理化性质及营养状况，促进植物生长，提高植物

健康水平,增强寄主植物的抗病能力；利用生防

着枸杞种植规模的不断扩大，病害的发生情况直

接影响到地区的经济发展和农民增收%25&。目前 生物防治代替化学防治土传病害是未来农业生

细菌、真菌及放线菌等拮抗微生物的寄生、抗生 作用，及其与病原菌的营养物质、生态位的竞争

效应抑制和消灭病原菌;诱导寄主植物产生对病

张小彦，等.枸杞根腐病菌拮抗菌株的筛选与鉴定-863 -原菌的系统抗性%29_31］ +近年来应用拮抗菌及其代谢物防控作物真 菌病害的研究时有报道。例如孙冬梅等［32］发现

无法满足实际生产的需要;许多生防产品的作用

机理尚不明确，导致室内抑菌试验和田间试验的 防治效果差异较大;最重要的是由于外界因素导 致防治效果不稳定叫因此，后期有必要对拮

抗菌株的抗菌机理以及制备稳定的生防菌株进

黄绿木霉菌(Trichoderua oureoviPPe)对大豆根腐 病镰抱菌具有良好的抑制作用。勾长龙等［33］从

人参根际土壤中筛选得到-株解淀粉芽芽杆菌

(Bacillus omylolipuefociens ) HB-3 ,能显著抑制人

行更加深入的研究。参考文献(References):参根腐病菌的生长,对人参根腐病有较强的生物 防治效果。黄铭慧［34］从大豆根际土壤中筛选出 一株具有较强抑菌效果的生防细菌贝莱斯芽芽

杆菌(B. velezensis ) +本研究从健康枸杞根际土壤中分离得到101 株细菌、52株放线菌、30株霉菌和27株酵母菌,

其中对枸杞致病菌F. solani有明显抑制效果的

菌株有2株，分另置定为绿僵菌Metarbizium和中

华根瘤菌属SinorgPobiumo绿僵菌对植物病原菌 的拮抗作用报道较少，现有报道以金龟子绿僵菌 为主。齐永霞等［35_36］研究表明，金龟子绿僵菌

Ma55菌株对3株枯萎病菌菌丝生长抑制率均超

过了 70%。杨帆等［37］首次以平沙绿僵菌菌株为 研究对象,发现该菌株对大豆根腐病菌尖镰抱菌

(FusaUum oxyseorum )、水稻稻瘟病菌(Mogno-

porthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctooia solani-

等7株植物病原菌均有不同程度的抑制作用，都 可以产生抑菌带。李云玲等［38］发现南方红豆杉 根际微生物草木樨中华根瘤菌(Sinorhizobium me-

Ploti) CHW10B的溶磷特性及促生作用。为了更

充分地利用并发挥根瘤菌的作用,今后的研究需

要致力于加强根瘤菌与植物的相互作用机理研 究,筛选优良菌种，从环境因素、基因表达以及基

因与环境相互作用的角度,深入研究根瘤菌的遗

传多样性以及生态特性,这也是未来实现农业可 持续发展的方向之一_40&。本实验证明分离出的两种内生菌均对枸杞

根腐病害生物防治领域有较大的应用潜力，后续

将深入探索上述菌株对枸杞根腐致病菌的抑菌

作用机制，结合田间病害防效测定，为枸杞病害

生物防治提供科学依据。虽然国内外学者对于植物病害的生物防治

研究已经取得了巨大大展,然而在实践中仍存在

诸多问题。生防微生物资源虽然丰富但能用于 作物生产的制剂或产品的种类和数量十分有限,

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