羧基磁珠与蛋白偶联方法(总
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羧基磁珠与蛋白偶联方法
来源： 时间：2009-6-6 23:34:26
简介
BioMag 和 BioMagPlus 超顺磁珠适用于磁分选细胞、细胞器、蛋白、免疫球蛋白、核酸及其它生物或非生物体系中的分子。BioMag 和 BioMagPlus 磁珠表面不规则，因此具有比较大的表面积，可以增加磁珠与偶联分子的接触机率，提高偶联效率。此外，这两种磁珠90%以上为氧化铁，可以加快磁分选速度，这特别适用于大批量，高能量分选样品。
BioMag and BioMagPlus 磁珠采用的工艺制备，只不过BioMagPlus经过了另,外的去除细尘处理，偶联试剂盒中提供的就为此类磁珠。
BioMagPlus 羧基磁珠表面的羧基经过二亚胺EDAC活化后，即可以与蛋白偶联。
Bangs 公司的 BioMagPlus Carboxyl Protein Coupling Kit 适用于蛋白与 BioMagPlus 超顺磁珠的偶联，此kit提供了可供5次偶联的试剂和磁珠。
材料
• BioMagPlus 羧基磁珠: 2.5mL，1.5μm ，20 mg/mL
• EDAC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide): 0.10g • 15mL 尖头离心管: 5 tubes • BioMag 磁分离器
• 0.05M MES 缓冲液 (pH 5.2): 2 x 175mL •淬灭液 (1M Glycine, pH 8.0): 25mL •洗涤缓冲液: 125mL
实验步骤
活化
•移取 0.5mL (10mg) 的 BioMagPlus 羧基磁珠至 15mL 尖头离心管内，并放置在磁分离架上直到上清液变完全透彻后，用吸管小心移弃上清。
• 加 5mL of MES 缓冲液充分混匀洗涤. 将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。
• 重复 Step 2, 三次. 最后一次洗涤后, 重悬磁珠于 5mL 的 MES 缓冲液中。
• 将 EDAC 从冷藏处取出置于室温30分钟。准确称取所需的EDAC (1.6mg EDAC/mg BioMagPlus 磁珠)加入装有磁珠的离心管内， •剧烈振荡摇匀。
• 室温下，将离心管置于旋转混匀仪上活化反应 30 分钟。反应过程中，注意不让磁珠沉淀聚积在一起。
• 将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。 • 重复 Step 2, 四次。
蛋白偶联
计算需要偶联的蛋白，抗体量. 一般地，每
mg活化的羧基磁珠可以偶联20-500ug的蛋白（抗
体），可适量添加一些载体蛋白，如BSA Fraction V，增加反应体系中的总蛋白量，从而可以起到一定的封闭作用。保证抗体偶联的正确方向。
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• 将蛋白加至 5mL MES 缓冲液中。
• 吸取 50μL 蛋白液于950μL的MES缓冲中. 配成1：20的稀释液. 标记为偶联反应前蛋白液.置于一旁用于后面的偶联率计算。
• 将剩下的蛋白液加到装有活化磁珠的离心管内，剧烈振荡混匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上偶联反应16-24小时。
•将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心收集上清. 标记为偶联后蛋白液，用于计算偶联率。
•重悬磁珠于 5mL MES 缓冲液中，振荡摇匀。将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。 • 重复 Step 6, 一次
• 加 5mL 的淬灭液，振荡摇匀，室温下，将离心管置于旋转混匀仪上 30 分钟。 • 将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。 洗涤和贮存偶联后的磁珠
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• 加 5mL 洗涤缓冲液并剧烈振荡摇匀。将离心管放在磁分离架上直到上清液变清后.用吸管小心移弃上清。
• 重复 Step 1, 三次。
• 最后一次洗涤后, 重悬磁珠于 2mL 洗涤缓冲液内，此时磁珠的浓度约为5 mg/mL. • 置于 2-8摄氏度保存。
Notes
• 偶联时切记不要用有氨基 (e.g. Tris) 或是羧基的 (e.g. acetate, citrate) 缓冲液。 • 偶联时，非偶联的吸附无可避免会有一些，这可以通过偶联后的洗涤来去除。 • 延长振荡的时间有利于重悬 BioMagPlus 磁珠。 贮存
贮存于2-8˚C。冷冻, 干燥, 或是离心都可能会使磁珠发生不可逆的聚积，影响实验结果。
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