抗组织型纤溶酶原激活物单克隆抗体的制备及其特性鉴定和初步应用

抗组织型纤溶酶原激活物单克隆抗体的制备及其特性鉴定和初步应用

张　敏,翁　屹3,杨晓峰,董艳秋,刘　兢(中国科学技术大学生命科学院细胞与分子免疫学实验室,安徽合肥230027)

关键词:杂交瘤;单克隆抗体;组织型纤溶酶原激活物(tPA);特

性鉴定

中图分类号:R730.51　　　　文献标识码:A

摘　要:目的　研制抗组织型纤溶酶原激活物(tPA)单克隆抗体(mAb),鉴定其各种生物学特性。方法　采用传统的细胞融合、有限稀释法,制备稳定分泌mAb的细胞株。采用辛酸、硫酸铵沉淀法,纯化腹水中的mAb,以SDS-PAGE鉴定其纯度。运用ELISA和细胞免疫组化染色,鉴定mAb的各项特性.结果　获得了两株能稳定分泌抗tPAmAb的细胞株。用该两株细胞分泌的mAb能检测出0.4μg/L重组的

tPA和血清中的tPA。结论　成功地研制了两株抗tPA的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件。

Preparation,charactorizationandpreliminaryap2plicationofmonoclonalantibodyagainsttissueplasminogenactivator

ZHANGMin,WENGYi3

,YANGXiao-feng,DONGYan-qiu,LIUJing

LaboratoryofCellandMolecularImmunology,SchoolofLifeScience,UniversityofScienceandTechnologyofChina,Hefei230027,AnhuiProvince,China

Keyword:hybridoma;monoclonalantibody;tissueplasminogen

activator;identificationAbstract:Aim　Toestablishcellofbiologicalactivitiesstrainssecretinganti-tissueplasminogenactivator,andidentifyitsre2latedcharacteristics,whichweusedforpreparingascites.Wepurifiedantibodyfromascites,anddetectedvariousfeaturesofpurifiedantibodies,sothatwecouldusethemforsciencere2searchandclinicaldiagnosis.Methods　Traditionalcellfusionandlimiteddilutionmethodswereusedtopreparehybridomacellstrainstablysecretinganti-tissueplasminogenactivatormAbs.ThemAbsinasciteswerepurifiedbycaprylicacid-am2moniumsulfatesaltingoutandthepurityofthemAbswasiden2tifiedbySDS-PAGE.RelativecharacteristicsofthemAbswereanalyzedbyELISAandimmunohistochemicalstaining.Results收稿日期　

:2001-12-03;　修回日期:2002-03-01基金项目:中国科学技术大学生物技术公司提供资助作者简介:张　敏(1967-),女,安徽淮南市人,硕士生.

合肥市金寨路96号,Tel.(0551)36062943通迅作者.Email:wengyi@ustc.edu.cn

Twostrainsofhybridomacellssecretinganti-tissueplasmino2

genactivatormAbswereobtained.Sensitivityofdetectingre2combinantandserumtPAreachedto0.4μg/L.Conclusion　Thetwostrainsofhybridomacellsstablysecretinganti-tPAmAbsaredevelopedsuccessfully.Theresultsobtainedprovideausefulreagentforclinicaldiagnosisandfurtherresearch.

　　组织型纤溶酶原激活物(tissueplasminogenacti2vator,tPA)是胰蛋白酶家族中的一种丝氨酸蛋白酶[1,2]。该酶能催化纤溶酶原转变为纤溶酶,进而催化纤维蛋白原转变为纤维蛋白(即纤维蛋白溶解的限速步骤),从而促进血栓溶解,对治疗心脑血管缺血型疾病具有重要意义[3]。研究血浆中tPA的水平,对预测心肌梗塞和中风等疾病有重要意义[4,5]。研究表明t-PA水平的升高,是预测心血管意外的指标[4],且其升高可出现于心血管疾病前几年[6]。我们研制抗组织型纤溶酶原激活物mAbs的目的在于测定血浆及其它组织液中tPA的水平.

1　材料和方法

1.1　材料　Balb/c小鼠购自第四军医大学(供制备

杂交瘤)和安徽医科大学(制备腹水)。Sp2/0细胞

由第四军医大学免疫教研室惠赠。脐静脉内皮细胞由本院王玉珍教授实验室提供。免疫及实验用的tPA由军事医学科学院提供,系基因工程表达的具有天然tPA含528个氨基酸序列的产品。PEG2000、HAT、HT和谷氨酰胺为Gibco公司产品,

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和氯化钠等为国产分析纯。Tween-20及辛酸为华美公司产品。96孔ELISA板为Nunc公司产品,RPMI10培养基及新生小牛血清购自Hyclone公司北京代理处。酶标仪Elx800型为美国BIO-TEKINSTRUMENTS公司产品.1.2　方法

1.2.1　抗tPAmAb的制备　①免疫动物:按照文献[7]的方法,采用腹腔及皮下多点注射,tPA(0.05mg/次)免疫8～12wk龄Balb/c小鼠,共4次,间隔2wk。融合前3d,再加强1次,间接ELISA效价达11∶60以上时,取脾细胞进行细胞融合。②细胞融合、

筛选、克隆化及腹水制备均按常规方法进行。1.2.2　鼠抗tPA多克隆抗体的制备　取已免疫的

ISSN10078738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2002,18(3)239

5只Balb/c小鼠经眼球放血,获得约2mL血液,分离血清后,纯化保存备用。1.2.3　腹水mAb的纯化及纯度鉴定　mAb的纯化采用辛酸、饱和硫酸铵沉淀法。将制备的腹水离心后,用辛酸沉淀,取上清,对pH7.4PBS透析过夜;再用饱和硫酸铵沉淀,12000r/min离心30min,沉淀用最小体积PBS溶解后,对PBS透析36～48h,得较纯的抗体,纯化后的mAb纯度鉴定采用SDS-PAGE。1.2.4　mAb检测tPA的敏感性　采用ELISA夹心法。参照文献[8,9]进行。用鼠抗人tPA多抗包被96孔微板,过夜,加入tPA抗原2h,再加入HRP标记的HRP-mAb1A3或HRP-mAb1B3,1h,加OPD底物显色,于波长490nm测定A值。1.2.5　mAb的表位分析　根据文献[10]加以改进进行。首先用1mg/LtPA铺板(4℃过夜或室温下震荡2h)。用封闭剂封闭45min后,依次加入mAb1A3和HRP-mAb1B3,或mAb1B3和HRPmAb1A3。其中mAb1A3、mAb1B3浓度均为2g/L,分别从10-2稀释到10-8,HRP-mAb1A3和HRP-mAb1B3的浓度分别为0.75g/L和1g/L,均再做15∶00稀释,并分别设立相应的未加mAb1A3和mAb1B3的对照进行ELISA并绘制成曲线。1.2.6　mAb亲和常数的测定　参照文献[11]进行。将1g/L的tPA从11∶02稀释至11∶08铺板,4℃过夜,加封闭剂封闭45min。加入纯化的mAb1A3或1B3,37℃2h和羊抗鼠HRP-IgG1h,以OPD底物于暗处显色5min,测定波长490nm的A值。

2　结果

2.1　mAb的一般特性和鉴定　我们获得两株能稳

定分泌抗tPAmAb的细胞株,纯化后mAb1A3和1B3浓度分别为12.8g/L和15g/L,效价分别为1×105和5×105,纯度可达90%以上。两株mAb均为IgG1亚类。mAb1A3和1B3能检测出重组tPA的最低水平为分别为1μg/L和0.4μg/L。两株mAb均识别同一抗原决定簇。

mAb1A3和1B3纯化后,经SDS-PAGE分析表明,出现相对分子质量(Mr)为约25000和50000的两条带,纯度可达90%以上(图1)。

mAb1A3的亲和常数为7.18×107、mAb1B3亲和常数为1.48×109。

2.2　tPA在脐静脉内皮细胞表达的检测　脐静脉内皮细胞,经用mAb1A3做免疫组化染色检测,发现该细胞的胞浆染呈棕黄色(图2)。

2.3　mAb的特异性　分别用1mg/L牛血清白蛋白、牛血浆纤维蛋白原、及尿激酶(uPA)代替tPA抗原,与mAb1A3和1B3做夹心ELISA,所获结果其

A490值均接近于空白对照;在同样情况下,用tPA1

mg/L铺板,其A490值超出了酶标仪的检测范围(3.5)。

图1　mAb1B3和1A3的SDS-PAGE鉴定

Fig1　IdentificationofmAbs1B3and1A3bySDS-PAGE

1:PurifiedmAb1B3;2:PurifiedmAb1A3;M:Proteinmarker.

图2　脐静脉内皮细胞中tPA的表达

Fig2　ExpressionoftPAinumbilicalveinendothelialcells(IHCstaining,×200)

2.4　mAb-ELISA的灵敏度　应用mAb1A3和1B3建立的夹心ELISA法检测标准tPA的最低量

为0.4μg/L。其中用HRP标记的mAb1A3检出的最低值为1μg/L,用HRP标记的mAb1B3检出的最低值为0.4μg/L。夹心ELISA检测tPA(标准品)的范围为1～8μg/L。2.5　mAb-ELISA的可重复性　以6份不同浓度的标准品tPA和1份阴性对照,每份设6个复孔,做夹心ELISA测定A值。平均批内的CV为3.41%,6份标准品tPA在3个不同检测日分别测定3次,所得平均批间的CV为5.8%。另取3份人血清标本从12∶倍比稀释到116∶后,测定tPA的含量。所获平均CV小于10%。2.6　血清中tPA含量的检测　应用我们建立的夹

心ELISA,检测了从合肥市第四人民医院肺科随机抽取的20份患者血清中tPA的含量,其含量范围为0-26μg/L。

240ISSN10078738细胞与分子免疫学杂志(ChinJCellMolImmunol)2002,18(3)3　讨论

tPA在人血浆中的含量很少,为μg/L水平,采

用ELISA夹心法定量测定血清中的tPA水平,不仅提高了灵敏度,也避免了放射性同位素的应用,降低了成本。要建立高灵敏度的ELISA夹心法,关键在于制备高质量的特异性抗体和酶标记抗体,同时要减少ELISA过程中的非特异性吸附,降低本底值。我们研制了两株抗分泌tPAmAb的杂交瘤细胞株,通过对ELISA操作过程中各种条件的摸索,使建立方法的灵敏度达到0.4μg/L,接近或超过国内外文献报道的水平[8,9],并鉴定了它们的有关特性。tPA由内皮细胞所分泌,贮存于细胞浆内[12],应用免疫组化法证明tPA表达于脐静脉内皮细胞胞浆中,与文献[12]的报道相一致。两株mAb的特异性鉴定表明,均是针对tPA的,与uPA等相关蛋白无交叉反应,而且两株mAb的亲和力高,这些也为提高ELISA检测的灵敏度提供了条件。SDS-PAGE分

析表明两株mAb的纯度可达到90%以上,检测出标准品tPA的灵敏度分别为1μg/L和0.4μg/L。mAb1A3的线性检测范围是1-8μg/L,如用于血浆中的tPA水平的检测,基本符合中国生物制品标准化委员会编的关于检测tPA的标准化规程的标准[13],只是检测的线性范围偏低,因而可能给检测高水平的tPA带来麻烦。因为在某些疾病如心肌梗塞、脑梗塞等中,其水平可超过20μg/L以上[3]。

本研究是在国内首次使用国产重组tPA制备抗tPAmAb,不仅解决了天然tPA来源困难的问题,而

且抗原纯度的提高,提高了所制备抗体的质量,为提

高检测的特异性奠定了基础。长期以来,人们一直在寻找预测心肌梗死高危人群发生栓塞危险的特异而敏感的检测指标。传统上将血清胆固醇、低密度脂蛋白(LDL)升高、高密度脂蛋白(HDL)降低、抽烟、饮酒等作为心肌梗死预测的检验指标,但是近年美国[14]、日本[6]、丹麦[5]等国的科学家运用前瞻性的统计学研究方法发现tPA对心脑血管缺血性疾病有的预测作用。而我国关于血浆tPA对于心梗、脑梗死等心脑缺血性疾病的预测研究还是空白,在国内开展该项研究将有助于在这个问题上与国际接轨,并为科学预防心脑血管疾病提供了理论依据。而该研究的核心是建立高灵敏度的检测系统,我们建立的夹心ELISA检测方法基本符合该检测要求。另外,由于脑损伤时,tPA可在神经系统中广泛表达,并认为tPA与神经轴突脱髓鞘有关,在神经系统的退化中起重要作用,因而提出阻断tPA或凝血酶

活性,对多神经损伤的治疗具有潜在的意义,但tPA用于治疗心脑血管缺血性疾病时,会出现大出血等症状[15]。因此研制人源化的抗tPA抗体使之特异性地结合tPA,阻断凝血酶原的进一步激活,可能有助于对该并发症的治疗。参考文献:

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