一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料及其制备方法和应用[发明专利]

(12)发明专利申请

(10)申请公布号 CN 110433325 A(43)申请公布日 2019.11.12

(21)申请号 201910680967.1(22)申请日 2019.07.26

(71)申请人 杭州中科润德生物技术发展有限公

司

地址 310018 浙江省杭州市经济技术开发

区白杨街道21号大街600号6幢610室(72)发明人 卢伟鹏　郭燕川　祝文威　穆瑞赓　(74)专利代理机构 成都方圆聿联专利代理事务

所(普通合伙) 51241

代理人 (51)Int.Cl.

A61L 24/00(2006.01)A61L 24/10(2006.01)D01F 4/00(2006.01)D01F 4/02(2006.01)

权利要求书1页 说明书6页 附图2页

D06M 10/00(2006.01)D06M 10/02(2006.01)D06M 101/10(2006.01)D06M 101/14(2006.01)

(54)发明名称

一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料及其制备方法和应用(57)摘要

本发明公开了一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料及其制备方法和应用，蛋白类高分子溶解配置成纺丝液；通过静电纺丝把蛋白类高分子制备成三维网状结构的纳米纤维；三维网状结构的纳米纤维在极化电场中进行极化处理；极化处理后的三维网状结构的纳米纤维进行干燥和灭菌，获得蛋白类高分子纳米纤维止血材料。本发明获得材料具有特殊的结构能有效激活凝血因子，提高单位体积纤维材料的止血效果，减少伤口部位的感染机率。这种材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，可作为一种止血材料。CN 110433325 ACN 110433325 A

权　利　要　求　书

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1.一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料的制备方法，其特征在于，所包括如下步骤：(1)蛋白类高分子溶解配置成纺丝液；

(2)通过静电纺丝把蛋白类高分子制备成三维网状结构的纳米纤维；(3)三维网状结构的纳米纤维在极化电场中进行极化处理；(4)极化处理后的三维网状结构的纳米纤维进行干燥和灭菌，获得蛋白类高分子纳米纤维止血材料。

2.根据权利要求1所述一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料的制备方法，其特征在于，所述的静电纺丝的方法为，以单一或混合液为溶剂，以蛋白类高分子为溶质，调节纺丝参数，制备得到分子链取向排列、纤维表面分布多种亲水基团的具有三维网络结构的纳米纤维材料。

3.根据权利要求2所述的一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料的制备方法，其特征在于，所述的溶剂是水、甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙醇、六氟异丙醇、六氟丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、丙酮、甲酮、丁酮、环己酮、乙醇、甲醇中的一种或者一种以上溶剂组成的混合溶剂；

所述的蛋白类高分子是胶原、明胶、丝素蛋白、蜘蛛丝蛋白、弹性蛋白、玉米醇溶蛋白、多肽中一种或者一种以上组成；

所述的纺丝参数，包括纺丝液浓度在2％～40％之间、纺丝电压在5～90kV之间、纺丝距离在5～30cm之间、纺丝液温度在0～70℃、环境温度0～65℃。

4.根据权利要求1所述一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料的制备方法，其特征在于，所述的极化处理，是指在极化电场中，电纺蛋白类纤维内部形成极化电荷或偶极子，羧基和氨基带电基团有序极化偏移，并吸附大量电场中激化的电荷，形成纤维内的空间束缚电荷。

5.根据权利要求4所述一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料的制备方法，其特征在于，所述的极化方式包括电晕极化、热极化、软X光极化、辐照极化和磁极化。

6.根据权利要求1所述一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料的制备方法，其特征在于，所述干燥，在真空干燥箱中干燥，干燥温度在35-80℃，干燥时间不超过48h。

7.根据权利要求1所述一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料的制备方法，其特征在于，所述灭菌，包括环氧乙烷灭菌、紫外灭菌或放射灭菌。

8.一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料，其特征在于，由权利要求1到7任一种方法制备所得。

9.根据权利要求8所述的一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料的应用，其特征在于，作为止血材料。

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一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料及其制备方法和应用

技术领域

[0001]本发明涉及纳米纤维制造领域，具体为一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料及其制备方法和应用。

背景技术

[0002]传统的止血材料(如棉纱、绷带、止血带等)对于不规则形状、深、窄、动脉破裂等现场常见创口的止血效果很不理想。无机矿物如沸石等止血材料在多风环境下很难使用，且可能造成严重灼伤，甚至残留脉管和肺部导致血栓。ɑ-氰基丙烯酸酯类止血材料降解过程中则难免释放出少量的氰和甲醛等有毒物质，引起组织炎症。随着科学技术的发展，人们逐渐把重心转移到新型的生物高分子材料开发上。天然的蛋白类高分子材料(如胶原、明胶、丝素等)具有良好的生物相容性和可降解性，是研究者们关注的重点。胶原蛋白电纺膜具有孔隙率高，吸水性能好的优点，可用于临床止血材料(程玮璐,李慧,贺金梅等.可降解复合止血胶原蛋白海绵的制备及生物应用性能研究[J].化学与粘合,2016,38(4):231-234)。在ICU有创动脉测压置管后穿刺点应用(何美珍，陈小燕，郑晶晶.明胶海绵在ICU有创动脉测压置管后穿刺点止血中的应用[J].护理学报.2015(22):40-41.)和拔牙创内止血实施例(朱绍平，张爱萍.可吸收明胶海绵拔牙创止血290例效果观察[J].山东医药.2003(35):69-69.)中，明胶海绵止血的简单、经济和有效性得到了患者和医护人员的认可。Sorada等(Sorada K,Siriporn D,Juthamas R.Aninnovative bi-layered wound dressing made of silk and gelatin for accelerated woundhealing.International Journal of Pharmaceutics,2012,436:141-153.)研究的丝素蛋白和明胶双层止血材料与商业上的止血材料相比能明显减少伤口面积，促进伤口愈合。然而在医疗领域对止血材料越来越高的性能需求下，蛋白类的止血材料仍然存在止血速度慢，对血液成分的牵拉能力以及创面组织附着力差的缺憾，因此如何提高蛋白类高分子止血材料的止血速度，使之在接触创口时能快速的激活凝血因子，加速凝血酶的生成，促使凝血块的形成是开拓此类材料应用的关键。

[0003]有研究表明，材料的表面电荷能够影响蛋白的选择性吸附和沉降，促进凝血系统的激活，特别是具有负电荷表面的材料能够通过其丰富的表面电荷来激活凝血系统中的凝血因子Ⅻ,而该因子是引发内源性凝血系统启动的关键因子之一(OstomelTA,ShiQ,Stoimenov PK,et al.Metal oxide surface charge mediated hemostasis.Langmuir.2007,23:11233-11238；Shariat-MadarZ,Mahdi F,Schmaier AH.Assembly and activation of the Plasmakallikrein/kininsystem:a new interpretation.International Immunopharmaeol.2002,2(13-14):1841-1849)。陈露等的研究表明，经过表面修饰而带正电荷的甲基化胶原其止血性能得到了很大的提高(陈露,李霞,蒋波.修饰胶原的止血活性研究[J].中外医疗.2013,32(23):130-131)。蛋白质是最重要的生物极化高分子材料，具有能够长期贮存真实电荷和(或)保持极化状态的能力(夏钟福.生物驻极体材料[J].材料导报.1994(1):48-52.)。在高压电场的作用下，羧基、氨基

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等带电基团趋于有序的极化偏移，并束缚大量电场中激化的电荷，使纤维表面形成了不同电位区域。静电纺丝是一种工艺简单的纳米纤维制备技术，相对于海绵止血材料，纳米纤维结构的材料比表面积更大，与血液的接触面积更多，凝血成分更易粘附聚集在纤维表面，从而缩短止血时间，提高止血效果(刘雪峰.创伤止血纳米纤维材料的制备与性能[D].南京:东南大学,2011:1-51)。更甚者高压静电场的存在和之后的纤维膜的极化处理，也为极性材料提供极化和捕捉电荷提供可能。

[0004]蛋白类高分子材料通过静电纺丝技术构建一种分子链取向排列，纤维表面分布多种亲水基团的三维微观网络结构的纳米纤维材料，再通过极化处理，使材料内部极化取向，表面分布极化电荷，从而在创口止血时能瞬时的吸收水分，吸附血液成分，在局部范围内增加血液粘度，并快速的激活凝血因子，加速凝血酶的生成，促进凝血过程，从而提高材料的止血速度。因此这类能快速止血的蛋白类生物可吸收止血材料在临床医学和紧急止血方面将具有更显著的优势。

发明内容

[0005]本发明的目的是针对蛋白类高分子止血材料可能引起的感染风险，提供一种提高单位体积止血效果的纳米纤维止血材料的制备方法。

[0006]本发明的另一目的在于提供一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料。[0007]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：[0008]一种蛋白类高分子纳米纤维止血材料的制备方法，包括如下步骤：[0009](1)蛋白类高分子溶解配置成纺丝液；[0010](2)通过静电纺丝把蛋白类高分子制备成三维网状结构的纳米纤维；[0011](3)三维网状结构的纳米纤维在极化电场中进行极化处理；[0012](4)极化处理后的三维网状结构的纳米纤维进行干燥和灭菌，获得蛋白类高分子纳米纤维止血材料。

[0013]所述的静电纺丝的方法为，以单一或混合液为溶剂，以蛋白类高分子为溶质，调节纺丝参数，制备得到分子链取向排列、纤维表面分布多种亲水基团的具有三维网络结构的纳米纤维材料。

[0014]所述的溶剂是水、甲酸、乙酸、丙酸、三氟乙醇、六氟异丙醇、六氟丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、丙酮、甲酮、丁酮、环己酮、乙醇、甲醇中的一种或者一种以上溶剂组成的混合溶剂；

[0015]所述的蛋白类高分子是胶原、明胶、丝素蛋白、蜘蛛丝蛋白、弹性蛋白、玉米醇溶蛋白、多肽中一种或者一种以上组成；纺丝液浓度在2％～40％之间。[0016]所述的纺丝参数，包括纺丝液浓度在2％～40％之间、纺丝电压在5～90kV之间、纺丝距离在5～30cm之间、纺丝液温度在0～70℃、环境温度0～65℃。[0017]静电纺丝方式包括多针纺、螺旋纺、金属丝纺、金属片纺和金属凸点纺等。[0018]步骤(3)所述的极化处理，是指在极化电场中，电纺蛋白类纤维内部形成极化电荷或偶极子，羧基和氨基带电基团有序极化偏移，并吸附大量电场中激化的电荷，形成纤维内的空间束缚电荷。

[0019]所述的极化方式包括电晕极化、热极化、软X光极化、辐照极化和磁极化。

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步骤(4)所述干燥，在真空干燥箱中干燥，干燥温度在35-80℃，干燥时间不超过

48h。

所述灭菌，包括环氧乙烷灭菌、紫外灭菌或放射灭菌。

[0022]本发明所获得的蛋白类高分子纳米纤维止血材料是由纤维直径在0.05～5μm之间的微纳米纤维组成，具有高的空隙率和比表面积的三维网络片状结构。作为止血材料[0023]非均质(粗糙)的纳米纤维三维结构材料，能有效提高亲水吸液性能；非均匀的带电表面和纤维表面的羧基与钠离子反应带来的刺激都能有效激活凝血系统中的凝血因子，促进凝血酶的生成，从而加速凝血过程。本发明通过静电纺丝工艺，构建一种具有特殊结构和功能的三维网络结构的纳米纤维止血材料。这种纤维材料，电纺时由于静电力的强力拉伸，分子链取向排列，纤维比表面积大，表面集中分布多种功能化的基团；极化时由于取向且紧密排列的分子结构，各向异性大，更易使明胶分子链形成极化电荷或偶极子，羧基和氨基等带电基团也会趋于有序的极化偏移，并吸附大量电场中激化的电荷，成为纤维内的空间束缚电荷，从而形成纳米纤维构成的非均匀带电荷表面，在一定程度上激活凝血系统中的凝血因子，促进凝血酶的生成，从而加速凝血过程，达到快速止血的目的。[0024]与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0025]本发明通过静电纺丝参数控制纤维的微观结构，使分子链取向排列的同时更多的极性基团(如羧基等)裸露在纤维表面，羧基与钠离子反应能刺激激活凝血因子。之后的极化处理，使纤维内部和表面获得极化取向和捕获空间电荷，从而获得由纳米纤维组成的非均匀带电荷表面。这种特殊的结构能有效激活凝血因子，提高单位体积纤维材料的止血效果，减少伤口部位的感染机率。这种材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，可以作为一种可吸收止血材料。

附图说明

[0026]以下附图为本申请的一部分，是对本发明的进一步阐明，但不构成对本发明的限定，其中：

[0027]图1为实施例2中的制备装置示意图；

[0028]图2为实施例2中的止血材料纤维结构SEM意图；[0029]图3为实施例2中止血材料实物图。

具体实施方式

[0030]下面结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。[0031]实施例1[0032](1)称取25g猪皮明胶加入到183g去离子水中，在常温下溶胀25min；[0033](2)把溶胀的明胶液放入55℃的水浴中磁力搅拌30min，使其完全溶解；[0034](3)在纺丝液温度为40-45℃，环境温度为30-35℃，热空气为环形侧吹风的情况下静电纺丝，网帘转速为8r/min；[0035](4)采用螺旋静电纺丝方式，电压为60kv，电流为0.12mA，纺丝距离为15cm；[0036](5)采用的极化方法是丝状电晕极化，电压为60kv，电流为3mA，极化距离为10cm；

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(6)获得明胶纳米纤维膜在40℃真空干燥箱中干燥24h后，用灭菌袋密封，环氧乙

烷灭菌后置于4℃保存；[0038](7)检测纺丝纤维直径呈正态分布，主要分布范围为320-1100nm；[0039](8)取明胶纳米纤维止血材料0.03g，现有市场对照样0.03g和空白样，按照0.01g/mL的比例加入混合血浆3.0mL，设置3个平行样，置于(37±1)℃生化培养箱下温育1h，用凝血酶原时间测定试剂盒和半自动凝血分析仪测定其凝固时间。测定结果为：空白组9.7±0.1s，市场样品对照组为20.2±3.3s，明胶纳米纤维止血材料为8.4±0.2s。三者之间有显著差异。

[0040]实施例2

[0041]采用图1所示的装置。[0042](1)称取18g牛骨明胶加入到207g去离子水中，在常温下溶胀20min；[0043](2)把溶胀的明胶液放入60℃的水浴中磁力搅拌30min，使其完全溶解；[0044](3)在纺丝液温度为40-45℃，环境温度为30-35℃，热空气为环形侧吹风的情况下静电纺丝，网帘转速为10r/min；[0045](4)采用螺旋静电纺丝方式，电压为60kv，电流为0.12mA，纺丝距离为17cm；[0046](5)采用的极化方法是丝状电晕极化，电压为60kv，电流为3mA，极化距离为10cm；[0047](6)获得明胶纳米纤维膜在40℃真空干燥箱中干燥24h后，用灭菌袋密封，环氧乙烷灭菌后置于4℃保存；[0048](7)检测纺丝纤维直径呈正态分布，主要分布范围为260-1300nm；[0049]实施例2获得的止血材料纤维结构SEM意图如图2所示，实物图如图3所示。[0050](8)取明胶纳米纤维止血材料0.06g，现有市场对照样0.06g和空白样，按照0.02g/mL的比例加入混合血浆3.0mL，设置3个平行样，置于(37±1)℃生化培养箱下温育1h，用凝血酶原时间测定试剂盒和半自动凝血分析仪测定其凝固时间。测定结果为：空白组9.7±0.1s，市场样品对照组为28.3±5.8s，明胶纳米纤维止血材料为8.1±0.1s。三者之间有显著差异。

[0051]实施例3[0052](1)称取18g鱼胶原加入到282g六氟异丙醇中，在常温下磁力搅拌溶解60min；[0053](2)把溶液静止除气泡30min，使其完全澄清；[0054](3)在纺丝液温度为20-25℃，环境温度为25-30℃，热空气为环形侧吹风的情况下静电纺丝，网帘转速为10r/min；[0055](4)采用多针头静电纺丝方式，电压为30kv，电流为0.12mA，挤出量为0.5ml/h/孔，纺丝距离为15cm；[0056](5)采用的极化方法是针状电晕极化，电压为60kv，电流为3mA，极化距离为10cm；[0057](6)获得纳米纤维膜在40℃真空干燥箱中干燥24h后，用灭菌袋密封，环氧乙烷灭菌后置于4℃保存；[0058](7)检测纺丝纤维直径呈正态分布，主要分布范围为350-1200nm；[0059](8)取纳米纤维止血材料0.06g，现有市场对照样0.06g和空白样，按照0.02g/mL的比例加入混合血浆3.0mL，设置3个平行样，置于(37±1)℃生化培养箱下温育1h，用凝血酶原时间测定试剂盒和半自动凝血分析仪测定其凝固时间。测定结果为：空白组9.7±0.1s，

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市场样品对照组为28.3±5.8s，明胶纳米纤维止血材料为8.6±0.2s。三者之间有显著差异。

[0060]实施例4[0061](1)称取18g鱼胶原加入到282g六氟异丙醇中，在常温下磁力搅拌溶解60min；[0062](2)把溶液静止除气泡30min，使其完全澄清；[0063](3)在纺丝液温度为20-25℃，环境温度为25-30℃，热空气为环形侧吹风的情况下静电纺丝，网帘转速为8r/min；[00](4)采用螺旋静电纺丝方式，电压为80kv，电流为0.25mA，纺丝距离为20cm；[0065](5)采用的极化方法是丝状电晕极化，电压为60kv，电流为3mA，极化距离为10cm；[0066](6)获得明胶纳米纤维膜在40℃真空干燥箱中干燥24h后，用灭菌袋密封，环氧乙烷灭菌后置于4℃保存；[0067](7)检测纺丝纤维直径呈正态分布，主要分布范围为300-1100nm；[0068](8)取明胶纳米纤维止血材料0.03g，现有市场对照样0.03g和空白样，按照0.01g/mL的比例加入混合血浆3.0mL，设置3个平行样，置于(37±1)℃生化培养箱下温育1h，用凝血酶原时间测定试剂盒和半自动凝血分析仪测定其凝固时间。测定结果为：空白组9.7±0.1s，市场样品对照组为20.2±3.3s，明胶纳米纤维止血材料为7.8±0.1s。三者之间有显著差异。

[0069]实施例5[0070](1)称取90g海绵状丝素纤维蛋白加入到180g无水甲酸中，在常温下溶解180min；[0071](2)把溶液静止除气泡30min，使其完全澄清；[0072](3)在纺丝液温度为20-25℃，环境温度为25-30℃，热空气为环形侧吹风的情况下静电纺丝，网帘转速为12r/min；[0073](4)采用金属丝静电纺丝方式，电压为45kv，电流为0.10mA，纺丝距离为12cm；[0074](5)采用的极化方法是丝状电晕极化，电压为60kv，电流为3mA，极化距离为10cm；[0075](6)获得纳米纤维膜在40℃真空干燥箱中干燥24h后，用灭菌袋密封，环氧乙烷灭菌后置于4℃保存；[0076](7)检测纺丝纤维直径呈正态分布，主要分布范围为300-1100nm；[0077](8)取纳米纤维止血材料0.03g，现有市场对照样0.03g和空白样，按照0.01g/mL的比例加入混合血浆3.0mL，设置3个平行样，置于(37±1)℃生化培养箱下温育1h，用凝血酶原时间测定试剂盒和半自动凝血分析仪测定其凝固时间。测定结果为：空白组9.7±0.1s，市场样品对照组为20.2±3.3s，明胶纳米纤维止血材料为8.6±0.4s。三者之间有显著差异。

[0078]实施例6[0079](1)称取90g海绵状丝素纤维蛋白加入到180g无水甲酸中，在常温下溶解180min；[0080](2)把溶液静止除气泡30min，使其完全澄清；[0081](3)在纺丝液温度为20-25℃，环境温度为25-30℃，热空气为环形侧吹风的情况下静电纺丝，网帘转速为12r/min；[0082](4)采用金属片静电纺丝方式，电压为60kv，电流为0.12mA，纺丝距离为15cm；[0083](5)采用的极化方法是软X光极化，电压为40kv，电流为6mA，极化距离为10cm，垂直

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辐照强度10keV；[0084](6)获得纳米纤维膜在40℃真空干燥箱中干燥24h后，用灭菌袋密封，环氧乙烷灭菌后置于4℃保存；[0085](7)检测纺丝纤维直径呈正态分布，主要分布范围为320-1100nm；[0086](8)取纳米纤维止血材料0.03g，现有市场对照样0.03g和空白样，按照0.01g/mL的比例加入混合血浆3.0mL，设置3个平行样，置于(37±1)℃生化培养箱下温育1h，用凝血酶原时间测定试剂盒和半自动凝血分析仪测定其凝固时间。测定结果为：空白组9.7±0.1s，市场样品对照组为20.2±3.3s，明胶纳米纤维止血材料为7.6±0.1s。三者之间有显著差异。

[0087]实施例7[0088](1)称取25g猪皮明胶加入到200g去离子水中，在常温下溶胀25min；[00](2)把溶胀的明胶液放入55℃的水浴中磁力搅拌30min，使其完全溶解；[0090](3)在纺丝液温度为40-45℃，环境温度为30-35℃，热空气为环形侧吹风的情况下静电纺丝，网帘转速为8r/min；[0091](4)采用螺旋静电纺丝方式，电压为60kv，电流为0.12mA，纺丝距离为15cm；[0092](5)采用的极化方法是热极化，电压为40kv，电流为2mA，极化距离为10cm，极化温度是70℃；[0093](6)获得明胶纳米纤维膜在40℃真空干燥箱中干燥24h后，用灭菌袋密封，环氧乙烷灭菌后置于4℃保存；[0094](7)检测纺丝纤维直径呈正态分布，主要分布范围为320-1100nm；[0095](8)取明胶纳米纤维止血材料0.03g，现有市场对照样0.03g和空白样，按照0.01g/mL的比例加入混合血浆3.0mL，设置3个平行样，置于(37±1)℃生化培养箱下温育1h，用凝血酶原时间测定试剂盒和半自动凝血分析仪测定其凝固时间。测定结果为：空白组9.7±0.1s，市场样品对照组为20.2±3.3s，明胶纳米纤维止血材料为8.3±0.2s。三者之间有显著差异。

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