顺铂缓释多囊脂质体的制备和体外释放性能研究_肖超菊

顺铂缓释多囊脂质体的制备和体外释放性能研究

肖超菊,齐宪荣,艾尼瓦尔,魏树礼

(北京大学药学院药剂系,北京100083)

摘要:目的　制备包封率高和缓释作用好的顺铂缓释多囊脂质体,并与反相蒸发法制备的顺铂普通脂质体比较其体外释药性能。方法　用复乳法制备顺铂多囊脂质体,非火焰原子吸收分光光度法测定顺铂含量,磷脂酶试剂法测定脂质体中磷脂的浓度。测定包封率和体外释药性。结果　顺铂多囊脂质体平均粒径为16.6μm,跨距为1.0。顺铂包封率可高达80%以上。顺铂缓释多囊脂质体的体外释药符合一级释药规律,释药t1 .7h,比反相蒸发2为37法制备的顺铂普通脂质体延长8.4倍。经差示热分析发现辅助膜稳定剂有明显的膜稳定作用。结论　顺铂多囊脂质体包封率高,并具有良好的缓释作用。

关键词:顺铂;多囊脂质体;制备;缓释性;释药性能

中图分类号:R943.41;R945.1　　　文献标识码:A　　　文章编号:0513-4870(2003)02-0133-05

＊

Preparationofcisplatinmultivesicularliposomesandreleaseofcisplatinfromtheliposomesinvitro

XIAOChao-ju,QIXian-rong,AINIWaer,WEIShu-li

(DepartmentofPharmaceutics,SchoolofPharmaceuticalScience,PekingUniversity,Beijing100083,China)

Abstract:Aim　Topreparecisplatinmultivesicularliposomeswithhighencapsulationefficiencyandsustained-releasecharacter,andcomparethereleasecharacteristicswithconventionalliposomespreparedbyreverse-phaseevaporationmethod.Methods　Cisplatinmultivesicularliposomeswerepreparedusingmultipleemulsionmethod.Theconcentrationsofcisplatinandlipidsintheliposomesweremeasuredbyflamelessatomicabsorbancespectroscopy(FAAS)andphosphalipidenzymereagentmethod,respectively.Theencapsulationefficiency,sizeandreleaseofthecisplatinfromtheliposomeswerestudiedinvitro.ResultsThemeandiameterofcisplatinmultivesicularliposomeswas(16.6±1.0)μm.Theencapsulationefficiencyofcisplatinwasmorethan80%.Thereleaseprofileinvitrofittedwithafirst-orderequation.Thereleasingt1 2ofcisplatinmultivesicularliposomesis37.7h,whichis8.4thatofconventionalliposomes.Co-membranestabilizerhasremarkablestabilizingeffectonthemultivesicularliposomalmembraneconfirmedbydifferentialscatteringcalorimetry(DSC).Conclusion　Thecisplatinmultivesicularliposomesshowedhighencapsulationefficiencyandsustained-releasecharacter.

Keywords:cisplatin;multivesicularliposomes;preparation;sustained-release;encapsulationefficiency　　顺铂(cisplatin,CDDP)属周期非特异性抗癌药,抗瘤谱较广,但在体内会很快和蛋白结合而失效,且铂的半衰期很长,体内的毒性大,存在肾毒性、神经

毒性、骨髓抑制和严重的胃肠道反应,因此临床应用受到。研究证明

[1]

与其抗癌作用及毒副作用一致。目前临床应用的CDDP制剂为注射用粉针剂。脂质体作为一种靶向药物载体,具有类似细胞的结构,在体内可以改变被包封药物的体内分布,并具有缓释效果,从而减少药

物的剂量和降低药物的毒性,提高药物的治疗指数。

脂质体根据结构可分为单室脂质体,如小单室脂质体(SUV,smallunilamellarvesicular),大单室脂质体(LUV,largeunilamellarvesicular);多室脂质体

,CDDP在组织中的浓度高低

收稿日期:2002-02-15.

＊通讯作者　Tel:86-10-62091584,Fax:86-10-62015584,

E-mail:qixr2001@yahoo.com.cn·134·药学学报ActaPharmaceuticaSinica2003,38(2):133-137

(MLV,multilamellarvesicular);和多囊脂质体(MVL,multivesicularliposomes)。单室脂质体和多室脂质体都为同心囊结构,膜一旦破裂,药物即漏出,此两类脂质体研究较多。区别于传统的单室脂质体和多室

脂质体,多囊脂质体具有不连续的药物溶液囊泡,这些囊泡被连续的非同心的类脂双分子磷脂膜所分隔,具有更多的包封容积和较大的粒径,尤其当某个囊泡破裂时,药物只从破裂囊泡释出,完整的囊泡仍然可以保持原状,因而有很好的缓释效应

[2]

辅助乳化剂的浓度(0.020,0.040,0.060mol·L)和初乳与4.0%的葡萄糖溶液的体积比(1∶1,1∶2.5,1∶4)4个影响因素做四因素三水平正交实验

[5]

-1

,以脂

质体的包封率作为指标筛选最佳实验条件。

脂质体形态及粒径分布　EPC-CH-TO=4.5∶4.5∶2(摩尔比)和辅助膜稳定剂1.6mg,制备CDDP多囊脂质体,在相差显微镜放大倍数为10×20时观察脂质体的形态、粒径,并照相。记录500个脂质体粒径,计算平均粒径和粒径分布。

铂标准储备液的制备　取金属铂粉0.1000g(含量99.99%),溶于王水8mL,加热回流溶解,蒸发至刚干,加入HCl0.5mL和NaCl0.01g,并再次蒸发至刚干,用2mL稀HCl溶解残渣,用去离子水稀释至100mL,本溶液含铂1g·L

[6]

成所需浓度。

-1

。

本文研究了CDDP的非同心多囊脂质备方法,测定了包封率、粒径分布及体外释放性能等,以使其在肿瘤部位注射后起缓释作用

[3]

,提高疗效并

降低其毒副作用。国内外尚未见CDDP多囊脂质体的报道。

,用去离子水稀释

材料与方法

药品、材料和仪器　顺铂(CDDP,山东齐鲁制药厂);卵磷脂(EPC,四川英格尔生物工程公司);胆固醇(CH,日本油脂株式会社);三油酸甘油脂(TO,北京金龙化学试剂有限公司);D(+)-无水葡萄糖(北京瀛海精细化工厂);氯化钠、无水乙醚、三氯甲烷等均为分析纯;非火焰原子吸收分光光度计(FAAS,美国);涡旋混合器(北京金北德工贸有限公司);JC-3超声处理机(通化市超声设备厂);80-2低速离心机(江苏金坛新一佳仪器厂);DSC-型差热分析仪(DSC-7型,美国PE公司);相差光学显微镜(MP3-30,Leica)。

CDDP多囊脂质体的制备　按处方精确称取EPC,CH和TO等置于带螺旋盖的小玻璃瓶中,加入适量氯仿和乙醚使其完全溶解(油相),缓慢滴加1g·LCDDP的5.0%的葡萄糖溶液(一水相),涡旋振荡并探针超声成初乳,取初乳1.0mL用注射器快速注入含0.040mol·L辅助乳化剂的4.0%葡萄糖溶液(二水相)中,涡旋振荡成复乳,迅速把复乳转移到250mL的平底锥形瓶中,用氮气吹除有机溶剂,即得多囊脂质体混悬液

[3]-1

-1

CDDP含量的测定　CDDP分子中含铂(Pt),通过火焰原子吸收分光光度法(FAAS)检测铂,对CDDP定量,分析条件如下:灯电流:10mA;波长为:265.9nm;光栅0.2nm;载气:氩气;流速:3mL·min

-1

;进样体积:20μL;测

量指标:峰面积。加热程序:干燥:80～120℃,60s;灰化:1200℃,8s;原子化:2700～2700℃,3s;清除:2750℃,3s

[7]

。

标准曲线的制备　取铂储备液稀释成浓度分别

-1

为0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mg·L的一系列铂溶液,用FAAS在265.9nm处测定其吸光度(用峰面积定量),以吸光度对质量浓度进行线性回归。

磷脂含量的测定　用磷脂酶试剂法按说明书操作,在501nm处测定脂质体中磷脂的含量。

脂质体包封率的测定　取脂质体混悬液1.0mL加0.9%氯化钠1.0mL混匀,2500r·min离心5min,分离上清液和沉淀。沉淀部分为CDDP多囊脂质体。上清液和沉淀分别用高纯水稀释到适当的浓度,用FAAS测定CDDP的含量。将离心分离的脂质体上清液和沉淀用磷脂酶试剂法分别测定上清液和沉淀中磷脂的量。用下面的公式分别计算CDDP回收率、磷脂回收率和脂质体的包封率:

CDDP回收率=多囊脂质体中CDDP的药量 CDDP的投药量

磷脂回收率=多囊脂质体中磷脂的量 磷脂的投入量

包封率=(多囊脂质体中CDDP的药量 多囊脂质体中磷脂的量) (CDDP的投药量 磷脂的投入量)-1

。

处方与实验条件的筛选　分别以药脂比(CDDP

的质量与类脂的摩尔数比,90.9,181.8和272.7μg·μmol)、三油酸甘油脂的量(4,2和1μmol)、辅助膜稳定剂的量(0.8,1.6和3.2mg)、氯仿-乙醚(体积比,2∶1,1∶1和1∶2)、离心速度(2500,3000,6000和12000r·min)为变量,以CDDP的包封率为指标进行单因素考察实验。再以EPC与CH的摩尔比(1∶2,1∶1,2∶1)、制备复乳时的振荡时间(5,10,20s)、-1

-1

肖超菊等:顺铂缓释多囊脂质体的制备和体外释放性能研究·135·

-1

多囊脂质体与单层脂质体体外释药性能的比较　分别以0.9%氯化钠溶液和90%的人血浆为释放介质进行缓释CDDP多囊脂质体与CDDP单层脂

质体的体外释放实验。分别取脂质体混悬液用0.9%氯化钠稀释1倍后,在2500r·min

-1

质量浓度为0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mg·L的铂标准液用FAAS法在265.9nm处测定其吸光度,以吸光度对铂质量浓度线性回归,相关系数r=0.99,表明在0.1～0.5mg·L

系。

4　脂质体形态及粒径分布

用相差光学显微镜在放大倍数为10×20时能看到一个大的脂质体中又分为很多小囊。多囊脂质体表面形态并不象单室脂质体那样圆整,放置后重新分散好,均匀度好(图1)。计数500以上,最大粒径为37.5μm,最小粒径为3.75μm,平均粒径为16.6μm,跨距为1.0。粒径分布符合正态分布规律(图2)。

-1

有良好的线性关

离心5

min,弃去上清液,将脂质体用0.9%氯化钠适量稀

释,置于1.5mL的离心管中,置37℃恒温摇床中,摇床的转速为12r·min

-1

。分别在0.17,4,8,18,24,

-1

72和168h取样,在2500r·min离心5min后,取上清液,测释放部分的CDDP浓度。同样将脂质体用人空白血浆适当稀释,分别在0.17,4,8,18和24h取样,2500r·minCDDP浓度。

-1

离心5min,测释放部分的

差示热分析　分别制备不同比例的多囊脂质体,取脂质体样品适量,在温度为10～150℃,升温速率为5.0℃·min为。

-1

的条件下测定脂质体的热行

结果

1　各因素对包封率的影响

当油-水相体积比不变时,改变药脂比,CDDP的包封率分别为.4%,82.4%和79.8%,由此可看出,药脂比的不同对包封率的影响不明显。改变TO的量,CDDP的包封率分别为73.4%,.4%和78.1%,可见TO的量为2μmol时,CDDP的包封率最高。改变辅助膜稳定剂的量,CDDP的包封率分别为74.3%,90.5%和67.3%,因此辅助膜稳定剂的量为1.6mg时最佳。改变氯仿与乙醚体积比,CDDP的包封率分别为59.6%,.4%和57.2%,因此氯仿-乙醚体积比为1∶1是最佳比例。改变离心速度,离心5min后,测其包封率依次为.4%,84.7%,79.6%和73.2%,发现离心速度越高包封率越低,离心速度过高可破坏多囊脂质体,因此选2500r·min离心5min。

4

2　正交实验L9(3)

根据处方和工艺因素对CDDP多囊脂质体包封率的影响,并进行F检验,筛选最佳实验条件。初乳与4.0%葡萄糖溶液体积比对CDDP包封率影响显著(P<0.05),其次是振荡时间(P<0.05),再其次是EPC与CH的摩尔比(P<0.1),辅助乳化剂的浓度影响最小。最佳条件是EPC-CH为1∶1,振荡时间为10s,辅助乳化剂的浓度为0.040mol·L4.0%葡萄糖溶液体积比为1∶2.5。3　测定CDDP的标准曲线-1

-1

Figure1　Lightmicrograghofcisplatinmultivesicularliposomessuspensionat10×20magnification

Figure2　Thesizedistributionofmultivesicularliposomes

5　脂质体包封率测定

用处方EPC-CH-TO=4.5∶4.5∶2(摩尔比)和辅助膜稳定剂1.6mg平行制备CDDP脂质体5份,测得其CDDP回收率为(46.5±1.5)%,磷脂回收率为(51.8±2.0)%,包封率为(90.1±1.1)%(n=5)。6　多囊脂质体与大单层脂质体的体外释药的比较

用反相蒸发法制备顺铂大单层普通脂质体。分,初乳与

·136·药学学报ActaPharmaceuticaSinica2003,38(2):133-137

别精密量取0.1mL的CDDP多囊脂质体和大单层脂质体,置于1.5mL的塑料离心管中,分别加入血浆0.9mL或生理盐水0.9mL作为释放介质,37℃恒温水浴振荡,12r·min,定时取出相应的离心管

离心,测定释放部分的CDDP的浓度,计算累积释药百分率(图3)。

在生理盐水中多囊脂质体释药的t1 2为37.7h,释药曲线符合一级方程,相关系数r=0.9990,大单层脂质体的释药t1 .0h,多囊脂质体的释药t1 2为42是大单层脂质体的释药t1 .4倍,可看出多囊脂2的9质体具有良好的缓释作用。多囊脂质体在血浆中的释药速率比在生理盐水中快,释药t1 2为4.8h,但是最终释药总量偏低。这可能是因为从脂质体释放出来的CDDP与血浆蛋白发生了结合,离心后与血浆蛋白一起去除,出现误差的缘故。7　差示热分析

分别制备添加和未添加辅助膜稳定剂的两种CDDP多囊脂质体,处方中添加了辅助膜稳定剂后制备的CDDP多囊脂质体的相变温度30.11℃(图4A)

-1

和熔点113.81℃(图4B),均比处方中未添加辅助膜稳定剂制备的多囊脂质体相变温度26.11℃(图4C)和熔点111.95℃(图4D)高,且相变和熔解时的ΔH都增加,说明处方中添加了辅助膜稳定剂后形成的

脂质体膜稳定性增强。

○

—○:Multivesicularliposomesin0.9%NaCl;□—□:LUV

liposomesin0.9%NaCl;△—△:Multivesicularliposomesin90%humanplasma

Figure3　Thereleaseprofileofcisplatinfromthe

multivesicularliposomesandlargeunilamellarvesicular(LUV)invitro(n=3, x±s)

A(peak30.11℃,ΔH4.47J·g-1)andB(peak113.81℃,ΔH1903.31J·g-1):Formulationcontainingsubsidiarymembranestabilizer;C(peak26.14℃,ΔH3.18J·g-1)andD(peak111.95℃,ΔH1654.87J·g-1):Formulationcontainingnosubsidiarymembranestabilizer

Figure4　Differentialscanningcalorimetry(DSC)analysisresultsofcisplatinmultivesicularliposomes

讨论

CDDP的非同心多囊脂质体的制备采用了复乳

法,即先将膜材溶于有机溶液中作为油相,与含有CDDP的葡萄糖水溶液混合形成初乳,再将此初乳与含有辅助乳化剂的葡萄糖水溶液混合形成复乳,挥发除去有机溶剂,即得包封有CDDP的非同心多囊脂质体。从制备原理上看,水溶性药物可以完全被多囊脂质体的包封,因而可以解决长期困扰人们的水溶性药物包封率不高的问题。在制备过程中影响CDDP包封率和释放快慢的原因主要是复乳的破裂和聚合以及膜的致密性等。影响膜性质的因素主要有膜材的组成、辅助膜稳定剂的类型和用量、辅助乳化剂的种类和用量、有机溶剂挥发速度等。膜材

的组成会引起膜刚性的变化,当膜的刚性不足时,膜易破裂,在挥发除去有机溶剂的过程中,不能得到稳定的脂质体。但是膜过于刚性时,脂质体内小囊膜的弯曲几率增加,类脂的排列不紧密,会使磷脂的亲脂性尾部暴露,发生膜的融合,引起脂质体内封药物

[8]

的泄漏。除了在油相中加入辅助膜稳定剂外,在水相也应加入辅助乳化剂稳定复乳,否则复乳很容易聚合破裂,以致包封率急剧下降甚至几乎没有多囊脂质体的形成;通过正交实验,发现初乳与4.0%葡萄糖溶液体积比、振荡时间、EPC与CH的摩尔比对包封率的影响显著,多囊脂质体必须悬浮在适量肖超菊等:顺铂缓释多囊脂质体的制备和体外释放性能研究·137·

的水相中才能稳定存在。室温对包封率影响显著,主要是因为温度影响有机溶剂的挥发速度和脂质材料的溶解度,因此实验温度应恒定。

在此研究中,CDDP多囊脂质体的包封率大于

80%,最高达到98%。而用相同处方组成按逆相蒸发法制备的传统的大单层脂质体的CDDP的包封率为24.9%(CDDP回收率为12.0%,磷脂回收率为48.6%)。多囊脂质体的包封率是传统脂质体的包封率的4倍左右。

多囊脂质体的体外释放实验显示,它的释药t1 2

是大单层脂质体的释药t1 2的9.4倍,具有很好的缓释作用。References:

[1]WangMM,CuiSN,PanQC.Thestudydevelopmentofa

newanticancerdrugCDDP[J].Cancer(癌症),1986,5(1):105-109.

[2]KatreNV,AshermanJ,SchafferH,etal.Multivesicular

liposome(DepoFoam)technologyforthesustaineddeliveryofinsulin-likegrowthfactor-I(IGF-I)[J].JPharmSci,

[7][6][5][4][3]

[8]

1998,87(11):1341-1346.

KimS,KhatibiS,HowellSB,etal.ProlongationofdrugexposureincerebrospinalfluidbyencapsulationintoDepoFoam[J].CancerRes,1993,53:1596-1598.

YeQ,AshermanJ,StevensonM,etal.DepoFoamtechnology:avehicleforcontrolleddeliveryofproteinandpeptidedrugs[J].JControlledRelease,2000,:155-166.FangJQ.Theorthogonaltableandexperimentdesign[A].FangJQ.MedicalStatisticsMethods(医药数理统计)[M].Beijing:People'sMedicalPublishingHouse,1995.266-268.

WeiSL,QiXR,YangJ.Studiesonpharmaceuticsofcisplatinethylcellulosemicrospheresformaxillaryarterialembolizationindogs[J].ActaPharmSin(药学学报),1992,27(5):381-384.LiWJ.Determinationofcisplatininbiologicaltissuesandfluidsbygraphitefurnaceatomicabsorptionspectreometry[J].ChinJPharmAnal(药物分析杂志),19,9(2):82-85.

WiessnerJH,HwandKJ.Bindingofinsulintotheexternalsurfaceofliposomes,effectofsurfacecurvature,temperature,andlipidcomposition[J].BiochimBiophysActa,1982,6(3):490-498.

中国药学杂志岛津杯第六届全国药物分析优秀论文评选交流会征文通知

为推动我国药物分析事业的发展,促进药物分析技术的交流,在中国药学会支持下,决定2003年举办中国药学杂志岛津杯第六届全国药物分析优秀论文评选交流会。征文通知如下:

征文内容　1.近几年国内外药物分析进展的综述,新理论、新技术、新方法的应用和药物分析的方法学研究;2.现代分析手段和检测新要求在中药分析中的应用;3.新药质量标准的建立和要求;4.新剂型或基因工程药物的质量控制;5.药物血药浓度监测、药动学、生物利用度和溶出度的研究论文;6.各类分析仪器的使用经验;7.药物制剂的快速分析检定新方法;8.毒物快速分析的检定;9.药物分析中的新发现、新发明和新改进;10.计算机和数学在药物分析领域中的应用;11.药物分析技术在打假中的应用。

征文要求　1.报送论文每篇字数限3000字左右(另页附中英文结构式摘要),综述限8000字以内(包括参考文献,并附英文题目),要求未公开发表及未在全国性会议上交流过(附单位介绍信),有一定创造性和指导意义)。2.论文体例、格式请参见《中国药学杂志》2002年第1期稿约,并将文稿软盘[FZ书版,Word文本(.TXT)格式]一并寄至编辑部。

其他事宜　1.本次会议通过论文交流后将评选出一等奖3名,二等奖6名,三等奖10名。2.征文截止时间:2003年5月10日,以邮戳为准。稿件及信封请注明(岛津征文)字样,寄北京东四西大街42号中国药学杂志编辑部收。邮编:100710。3.会议时间及地点:2003年6月。地点:苏州。4.应征论文被录用后,将通知作者,论文录用与否,一律不退稿。