(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 107121507 A(43)申请公布日 2017.09.01
(21)申请号 201710262688.4(22)申请日 2017.04.20
(71)申请人 浙江大学
地址 310013 浙江省杭州市西湖区余杭塘
路866号(72)发明人 罗自生 王毅 葛志伟 (74)专利代理机构 杭州天勤知识产权代理有限
公司 33224
代理人 胡红娟(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)G01N 30/14(2006.01)
权利要求书1页 说明书12页 附图4页
CN 107121507 A(54)发明名称
一种笋壳多酚物质测定方法(57)摘要
本发明公开了一种笋壳多酚物质测定方法，属于植物多酚制备检测领域。所述方法包括：(1)多酚物质提取：以笋壳干粉末为原料，超声波辅助有机溶剂浸提，获得笋壳浸提液，再经大孔树
(2)已知组分含量测定：脂分离获得多酚提取液；
绘制已知组分标准品浓度与超高效液相色谱峰面积之间关系的标准曲线，利用超高效液相色谱对所述多酚提取液进行分析，测得对应已知组分的峰面积，根据标准曲线计算得到已知组分的含量；(3)未知组分鉴定分析：利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱，鉴定所述多酚提取液中的其余多酚物质。本发明方法分析检测结果准确，而且操作简单、重复性好，为进一步研究植物中的多酚物质提供技术平台。
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权 利 要 求 书
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1.一种笋壳多酚物质测定方法，其特征在于，包括：(1)多酚物质提取：以笋壳干粉末为原料，超声波辅助有机溶剂浸提，获得笋壳浸提液，再经大孔树脂分离获得多酚提取液；
(2)已知组分含量测定：绘制已知组分标准品浓度与超高效液相色谱峰面积之间关系的标准曲线，利用超高效液相色谱对所述多酚提取液进行分析，测得对应已知组分的峰面积，根据标准曲线计算得到已知组分的含量；
(3)未知组分鉴定分析：利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱，鉴定所述多酚提取液中的其余多酚物质。
2.如权利要求1所述的笋壳多酚物质测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机溶剂为体积百分比为60％的乙醇溶液，与笋壳干粉末的液料比为25:1。
3.如权利要求1所述的笋壳多酚物质测定方法，其特征在于，步骤(1)中，浸提的温度为70℃。
4.如权利要求1所述的笋壳多酚物质测定方法，其特征在于，步骤(1)中，超声波辅助浸提的时间为40min。
5.如权利要求1所述的笋壳多酚物质测定方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大孔树脂为大孔树脂D101。
6.如权利要求1所述的笋壳多酚物质测定方法，其特征在于，步骤(2)中，已知组分为焦棓酸、没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸、芦丁或对香豆酸中的一种或几种。
7.如权利要求1或6所述的笋壳多酚物质测定方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的梯度洗脱条件为：(1)0min，流动相A 98％，流动相B 2％；(2)0.5min，流动相A 95％，流动相B 5％；(3)4min，流动相A 92％，流动相B 8％；(4)7min，流动相A 80％，流动相B 20％；(5)10min，流动相A 75％，流动相B 25％；(6)13min，流动相A 30％，流动相B 70％；(7)16min，流动相A 5％，流动相B 95％；(8)17min，流动相A 98％，流动相B 2％；(9)20min，流动相A 98％，流动相B 2％；
其中流动相A为0.5％甲酸溶液、B相为含有0.5％甲酸的乙腈，流速0.4mL/min，柱温30℃，进样量10μL，检测器为紫外可见光，检测波长254nm。
8.如权利要求1所述的笋壳多酚物质测定方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱包括一级质谱和二级质谱，一级质谱条件采用负离子模式，毛细管电压-4.5kV，离子源温度550℃，喷雾器压力3.5bar，干燥气体N2压力为2.5bar，锥孔电压100V，碰撞能量10eV；二级质谱除了碰撞能量为50±20eV，其他同一级质谱；
数据采集采用全扫描模式，前体离子m/z 100-1500，产物离子m/z 50-1500。
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说 明 书
一种笋壳多酚物质测定方法
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技术领域
[0001]本发明涉及植物多酚制备检测领域，具体涉及一种笋壳多酚物质测定方法。背景技术
[0002]竹子的幼茎即竹笋，因其质嫩味美，营养丰富，素有“寒土山珍”之美誉。我国作为竹子生产大国，每年有约400万吨竹笋加工，产生了大量笋壳等废弃物，除少数笋壳被加工成包装材料、中高档用纸或深加工成动物饲料外，其余都当作废料处理，既污染了环境，又造成了资源浪费。
[0003]目前涉及笋壳的研究报道较少，为了实现竹笋资源的深度转化和综合利用，首要解决的关键问题之一，就是对笋壳进行系统的组分分析，探索其中最有开发利用价值的功能活性成分，进行定性和定量研究，为工艺学和功能性研究奠定基础。已有研究显示，笋壳中富含多种生物活性分子，其中以多酚、甾醇、萜类和黄酮等为主要成分，其中多酚的邻位酚羟基极易被氧化，具有很强的抗氧化活性和清除自由基的能力。研究表明多酚物质具有抗肿瘤、抗氧化、抗动脉硬化、防治冠心病与中风等心脑血管疾病以及抗菌等多种生理功能，因此其在食品、医药及化工用品方面具有极大的应用价值。[0004]现下多酚类物质的提取方法主要包括溶剂提取、微波及超声波辅助提取、酶法提取、超临界流体萃取等。如申请公布号为CN 103585498A的专利文献公开了一种竹笋中多酚的提取和检测方法，其中利用超声波辅助有机溶剂低温提取竹笋中多酚，具体公开：取出一定量竹笋置于研钵中，加入液氮研碎，按1g竹笋加入10mL 30％丙酮进行提取，于10℃以下低温超声提取15～60min，离心取上清，即得竹笋多酚提取液；超声提取频率为40kHz，超声功率150W，提取时间为45min。
[0005]鉴于多酚易氧化的特性，合理的提取时间和温度对防止多酚结构被破坏极为关键，因此保持多酚生物活性的同时提高提取效率，建立高效、快捷、经济、实用的提取方法，并对多酚物质进行鉴定分析，为笋壳的再利用提供理论指导，是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
[0006]本发明的目的是提供一种笋壳多酚物质测定方法，为笋壳的再利用研究提供更有效、快捷的鉴定手段。
[0007]一种笋壳多酚物质测定方法，包括：[0008](1)多酚物质提取：以笋壳干粉末为原料，超声波辅助有机溶剂浸提，获得笋壳浸提液，再经大孔树脂分离获得多酚提取液；[0009](2)已知组分含量测定：绘制已知组分标准品浓度与超高效液相色谱峰面积之间关系的标准曲线，利用超高效液相色谱对所述多酚提取液进行分析，测得对应已知组分的峰面积，根据标准曲线计算得到已知组分的含量；[0010](3)未知组分鉴定分析：利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱，鉴定所述
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多酚提取液中的其余多酚物质。[0011]步骤(1)中，笋壳干粉末由新鲜笋壳50℃烘干后粉碎制得，为提高提取率，将粉末过280μm筛子，再加入到液料比为10～30:1的体积百分比浓度为30～70％的乙醇溶液，在30～70℃条件下超声提取10～50min，再冷却、抽滤获得多酚浸提液。[0012]作为优选，所述有机溶剂为体积百分比为60％的乙醇溶液，与笋壳干粉末的液料比为25:1。
[0013]作为优选，浸提的温度为70℃。[0014]作为优选，超声波辅助浸提的时间为40min。[0015]作为优选，所述大孔树脂为大孔树脂D101。本发明研究发现，相较于其他的大孔树脂，大孔树脂D101能有效分离出浸提液中的多酚物质。
[0016]本发明根据笋壳原料中多酚物质的理化性质优化超高效液相色谱条件。作为优选，步骤(2)和(3)中，所述超高效液相色谱的梯度洗脱条件为：(1)0min，流动相A98％，流动相B 2％；(2)0.5min，流动相A 95％，流动相B 5％；(3)4min，流动相A 92％，流动相B 8％；(4)7min，流动相A 80％，流动相B 20％；(5)10min，流动相A 75％，流动相B 25％；(6)13min，流动相A 30％，流动相B 70％；(7)16min，流动相A5％，流动相B 95％；(8)17min，流动相A98％，流动相B 2％；(9)20min，流动相A98％，流动相B 2％；[0017]其中流动相A为0.5％甲酸溶液、B相为含有0.5％甲酸的乙腈，流速0.4mL/min，柱温30℃，进样量10μL，检测器为紫外可见光，检测波长254nm。[0018]步骤(2)中，已知组分为焦棓酸、没食子酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸、芦丁或对香豆酸中的一种或几种。
[0019]上述8种组分对应的出峰时间(min)分别为1.551、1.913、3.830、3.5、4.479、5.553、5.881、6.165。根据对应时间下的峰面积计算相应组分的含量。[0020]步骤(3)中，质谱包括一级质谱(MS)和二级质谱(MSMS)，一级质谱条件采用负离子模式，毛细管电压-4.5kV，离子源温度550℃，喷雾器压力3.5bar，干燥气体N2压力为2.5bar，锥孔电压100V，碰撞能量10eV；二级质谱除了碰撞能量为50±20eV，其他同一级质谱；
[0021]数据采集采用全扫描模式，前体离子m/z 100-1500，产物离子m/z 50-1500。[0022]本发明具备的有益效果：[0023](1)利用本发明的提取方法，可有效地从笋壳中提取到多酚物质，同时保证多酚的生物活性。[0024](2)利用超高效液相色谱对笋壳样品中的已知多酚组分定量，利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱对笋壳样品中其余的酚酸、黄酮和有机酸组分进行分析鉴定与推测，分析检测结果准确，而且操作简单、重复性好，为进一步研究植物中的多酚物质提供技术平台。
附图说明
[0025]图1为不同料液比对笋壳多酚提取率影响的折线图。
[0026]图2为不同乙醇体积分数对笋壳多酚提取率影响的折线图。[0027]图3为不同提取温度对笋壳多酚提取率影响的折线图。
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图4为不同超声波提取时间对笋壳多酚提取率影响的折线图。
[0029]图5为笋壳多酚的UPLC色谱图，其中(A)为笋壳多酚提取液的色谱图；(B)为标准品的色谱图。
[0030]图6为笋壳多酚的UPLC-Triple-TOF/MS质谱图。
具体实施方式
[0031]下面结合具体实施例对本发明作进一步阐释，本实施例根据发明技术方案进行实施，给出了详细的实施方式和操作步骤，但本发明的保护范围并不限于下述的实施例。[0032]实施例1[0033](1)将笋壳于50℃烘干，粉碎后过0.28mm筛子。称取样品粉末，调节液料比，加入乙醇溶液，在一定温度下超声提取，冷却，抽滤。将滤液定容至50mL，静置10min，准确吸取1.0mL待测液于10mL容量瓶中，在760nm下测定吸光值，根据回归方程计算多酚质量。[0034]本实施例中设置4个单因素实验，分别如下：[0035]因素1：调节液料比分别为10:1、15:1、20:1、25:1、30:1，结果如图1示。[0036]因素2：调节乙醇溶液浓度分别为30％、40％、50％、60％、70％，结果如图2示。[0037]因素3：调节提取温度30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，结果如图3示。[0038]因素4：调节超声时间分别为10min、20min、30min、40min、50min，结果如图4示。[0039]优选液料比25：1，乙醇体积分数60％，超声温度70℃，超声时间40min，笋壳多酚平均得率为8.67±0.65％。[0040](2)选用大孔树脂D101，准确称取1.00g预处理过的大孔树脂D101于100mL锥形瓶中，加入25mL浓度为C0(吸附前试液中多酚质量浓度)的笋壳多酚粗提液，用锡纸包裹避光密封置于振荡器中，30℃、120r/min震荡4h，充分吸附后，从上清液中取样，用福林酚法测定多酚质量浓度(C1)并计算吸附率。[0041]将充分吸附的树脂过滤，用蒸馏水冲洗后滤于置于100mL锥形瓶中，分别加入70％的乙醇溶液25mL，在上述相同条件下解吸，从上清液中取样，用福林酚法测定多酚质量浓度(C2)并计算解吸率。
[0042]经计算其吸附量为0.397mg/g，吸附率为76.47％，解析率为15.％。[0043](3)超高效液相色谱分析：色谱柱为沃特世HSS T3(1.8μm，3.0×50mm)，流动相A相为0.5％甲酸溶液、B相为含有0.5％甲酸的乙腈，流速0.4mL/min，柱温30℃，进样量10μL，检测器为紫外可见光，检测波长254nm。[0044]色谱梯度洗脱条件：(1)0min，流动相A98％，流动相B 2％；(2)0.5min，流动相A 95％，流动相B 5％；(3)4min，流动相A 92％，流动相B 8％；(4)7min，流动相A 80％，流动相B 20％；(5)10min，流动相A 75％，流动相B 25％；(6)13min，流动相A 30％，流动相B 70％；(7)16min，流动相A 5％，流动相B 95％；(8)17min，流动相A 98％，流动相B 2％；(9)20min，流动相A98％，流动相B 2％。
[0045]同时以表1中所示8种组分的标准品作超高效液相色谱分析，所述标准品的浓度已知。
[0046]UPLC分析结果如图5和表1所示。[0047]表1笋壳多酚UPLC分析结果
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(4)超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱分析
[0050]色谱条件：色谱柱为沃特世HSS T3(1.8μm，3.0×50mm)，流动相A相为0.5％甲酸溶液、B相为含有0.5％甲酸的乙腈，流速0.4mL/min，柱温30℃，进样量10μL，检测器为紫外可见光，检测波长254nm。
[0051]色谱梯度洗脱条件：(1)0min，流动相A 98％，流动相B 2％；(2)0.5min，流动相A 95％，流动相B 5％；(3)4min，流动相A 92％，流动相B 8％；(4)7min，流动相A 80％，流动相B 20％；(5)10min，流动相A 75％，流动相B 25％；(6)13min，流动相A 30％，流动相B 70％；(7)16min，流动相A 5％，流动相B 95％；(8)17min，流动相A 98％，流动相B 2％；(9)20min，流动相A98％，流动相B 2％。[0052]质谱条件：采用负离子模式检测，毛细管电压-4.5kV，离子源温度550℃，喷雾器压力3.5bar，干燥气体(N2)压力为2.5bar，锥孔电压100V，碰撞能量10eV；对于二级质谱采集模式，参数都与一级质谱相同，只除了碰撞能量为50±20eV。质谱测定数据采用全扫描模式采集，前体离子m/z 100-1500，产物离子m/z 50-1500。[0053]UPLC-Triple-TOF/MS分析结果如图6和表2所示。[0054]表2笋壳多酚UPLC-Triple-TOF/MS分析结果
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*(P)酚酸；(F)黄酮；(O)有机酸；(N)新木脂素；(I)环烯醚萜苷
[0063]经分析，共检测出15种酚酸、7种黄酮、20种有机酸、1种新木脂素和1种环烯醚萜苷。根据保留时间和化合物碎片，与UPLC结果对比，鉴别出的酚酸有没食子酸(峰2，保留时间2.000min)、绿原酸(峰5，保留时间3.718min)、对羟基苯甲酸(峰6，保留时间3.874min)、绿原酸(峰11，保留时间4.521min)、阿魏酸(峰22，保留时间6.261min)；黄酮有对香豆酸(峰18，保留时间5.638min)、芦丁(峰21，保留时间6.001min)。此外，其余9种酚酸，其中峰3(2.96min)、峰5(3.718min)和峰7(3.293min)都在m/z为353.0882[M-H]-处显示了负离子峰，表明这三者为同分异构体；峰4(3.604min)、峰8(3.923min)、峰12(4.567min)、峰14(4.902min)、峰25(7.135min)和峰28(7.693min)都有一个去质子化的奎尼酸片段C7H11O6-(191.0561m/z)。其余5种黄酮，峰19(5.922min)在m/z 533.1331处有一个负离子峰；峰26(7.293min)在m/z547.1449[M-H]-处有一个负离子峰，且前体离子失去了C3H7O32-片段，在
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m/z 457.1141处形成了一个片段；峰27(7.600min)可能对应于水仙甙；峰29(7.783min)在m/z299.0563[C16H11O6]-处有一个强MS2离子，这可能来源于山奈素的功能团；峰34(11.361min)为5,7,4'-三羟基-3',5'-二甲氧基黄酮。
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