结肠癌Caco2细胞株无血清培养技术研究

•论 著•

结肠癌Caco-2细胞株无血清培养技术研究！

陈小燕#，吴应强2,赵逵1，朱蓉1

(遵义医学院附属医院1消化内科2全科医学科，贵州遵义563099)

[摘要]

目的探索人结肠癌Caco-2细胞株肿瘤干细胞的分选方法％方法应用无血清悬浮培养法培养Caco-2细胞，产

Caco-2细胞在无血清培养基

生肿瘤细胞球，并对肿瘤细胞球从形态学、分化、自我更新及交替培养等方面进行鉴定％结果

(SFM)中可存活，24h后可产生少量体积较小松散的悬浮肿瘤球，肿瘤球体积随时间延长而增大；将肿瘤球接种于完全培养基中 12h后细胞贴壁生长，细胞形态与传统培养形成的单细胞层无明显差异，重新消化贴壁细胞后再次悬于SFM中24#72 h后仍可 形成悬浮细胞球，其形态与原代相同％结论结肠癌Caco-2细胞在SFM中可生成悬浮肿瘤细胞球，采用无血清悬浮培养法可达 到富集肿瘤干细胞的目的％

[关键词]培养基，无血清+

结肠肿瘤+ 肿瘤干细胞；Caco-2细胞

中图法分类号：R735. 3D5 ; Q813. 1文献标识码：A

DOI：10. 3969\". issn. 1009-5519. 2019. 02. 006 文章编号：1009-5519(2019)02-0176-03

Study on serum-free culture technique of colonic cancer cell line Caco-2!

CHEN Xtaoyan1 !U Yingqiang2，ZHAO Km1，ZH'URong1 (1. Department of Gastroenterology ；2. Department of General Medicine，Affiliated Hospital ofZunyiMedical College，Zunyi，Guizhou 563099，China )

[Abstract] Objective To explore the method of sorting cancer stem cells in human colonic cancer cell line Caco-2. MethodsCaco-2 cells were cultured by using the serum-free suspension culture method and produced tumor cell spheres. The tumor cellspheres were

identified by

morphology,differentiation,self-renewal

loose

floating tumor

and

alternation culture. Results Caco-2

24 After

h. 12

free medium(SFM) ,and a small amount of increased with time

spheres were generated after

a complete medium.

c

T

extending. The tumor spheres were inoculated in h

thewall. The cellularmorphology was not significantly different from that of traditional cultured single-cell layers. After re-diges­ting the adherent cells,they were resuspended in SFM for 24—72 h. After the formation of suspended cell spheres,the morphology was the same as that of the primary cells. Conclusion Colonic cancer Caco-2 cells can generate the suspended tumor cell spheres inSFM and adopting

SFM suspending culture

method can

reach the goal

for

enriching tumor

stem

[Key words] Culture medium , s erum-free； Colonic neoplasms； Cancer stem cells； Caco-2 cells

c

近年来，越来越多的实验证据显示，多种实体瘤

中存在少量的肿瘤干细胞（CSCs)[1-3。CSCs具有自 我更新、无限增殖及多向分化能力，被认为是肿瘤发 生的根源，且在肿瘤发展、转移、复发中具有重要作 用。因此，CSCs理论为肿瘤研究和治疗提供了新的 方向，并预示着基于肿瘤细胞随机化理论的传统肿瘤 研究将转变为针对为数极少的一个亚群——CSCs方 面。研究CSCs的关键是CSCs的分离、培养及生物 学特性的鉴定。流式细胞分选术、磁珠激活细胞分选 法及无血清培养法是目前分选CSCs的常用方法。流 式细胞分选术和磁性活化细胞分选法均需通过识别 肿瘤细胞表面特异性标记物来分选、鉴定CSCs。而 结肠癌中虽然有CSCs的存在[45]，但却缺乏公认的 CSCs特异性标志物。因此，运用上述2种分选法分 离结肠癌CSCs并不理想。

无血清培养法是指在各类型培养基中添加如重 组人表皮细胞生长因子（EGF)、神经因子（B27)、重组 人碱性成纤维生长因子（bFGF)等作为血清替代物， 此种无血清培养基（SFM)既保留了细胞赖以生存的

必需营养物质如胰岛素、转铁蛋白、孕酮等，又去除了

血清中的促分化剂，在此种培养基中仅有一小部分具 有多向分化潜能的CSCs能存活下来，悬浮生长形成 肿瘤细胞球，其余肿瘤细胞则死亡，从而实现对CSCs 的分离[6]。有研究表明，无血清培养法可有效地筛选 出CSCs[7]。与前2种分选方法比较，无血清培养法 简单易行，且更有效。本研究应用无血清培养法富集 人结肠癌Caco-2细胞中的CSCs，并从形态学、分化、 自我更新及交替培养等方面进行了鉴定，旨在探索 Caco-2细胞中CSCs的分选方法。

1材料与方法

1.1材料Caco-2人结肠癌细胞株由湖南湘雅大学 细胞实验室提供，杜氏改良Eagle培养基（DMEM)高 糖培养基和特级胎牛血清购自USA Hyclone公司， EGF 和 bFGF 购自 USA PepioTech 公司，B27 购自 USA Sigma 公司。1.2方法

1. 2.1 完全培养基（SSM)和SFM的配制 SSM为 含10O胎牛血清的DMEM高糖培养基;SFM则为按

基金项目：国家自然科学基金项目#1560467);贵州省科学技术基金项目（黔科合LH字〔20143573号）。 作者筒介：陈小燕（1986 — )，硕士研究生，主治医师，主要从事大肠癌的研究。

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比例#5 : 1 : 1 : 2 : 1)分别加入DMEM高糖培养 基、EGF、bFGF、B27及双抗溶液。

7 2. 2细胞的传代培养将人结肠癌Caco-2细胞株 培养于含10O胎牛血清的完全培养液中，37. 0 °C、含 50 mL/L二氧化碳培养箱内培养，待细胞贴壁融合度 为80%〜90〇时用0. 25O胰酶-0. 02O乙二胺四乙酸 (EDTA)混合消化液消化传代继续培养。选取对数生 长期细胞用于本实验。

7 2.3悬浮培养法分离和传代CSCs参照文献[8] 采用的悬浮培养法。取对数生长期人结肠癌Caco-2 传统培养形成的单细胞层无明显差异。见图3。重新 消化贴壁细胞后再次悬于SFM中，2%〜72h后仍可 形成悬浮细胞球，其形态与原代相同。

细胞，用0. 25%胰酶-0. 02OEDTA消化液消化离心， 收集细胞，用磷酸盐缓冲溶液离心洗涤2次后重悬于 SFM中，置于5%二氧化碳、37 C条件下培养，隔2天 换液1次；培养瓶中出现大量悬浮细胞球时收集细 胞，加入胰酶消化后用吸管轻轻吹打即可得到单个细 胞，按1 : 2传代，继续在SFM中培养，此即悬浮球细 胞的传代培养+寺增殖形成细胞球3〜％ d后将其收集 于离心管中，自然沉降20 min弃半量陈旧上清液，加 入等量新鲜SFM继续培养。

7 2. 4 CSCs交替在SSM和SFM中培养 按1.2. 2、1.2. 3项方法，待CSC@在SFM中出现大量悬 浮细胞球后收集细胞并重悬于SSM中。每天观察 Caco-2肿瘤细胞球在SSM中分化成贴壁生长的单层 细胞的过程。待其呈单层细胞贴壁生长后，再收集并 重悬于SFM中，继续观察Caco-2细胞在SFM中重 新形成悬浮肿瘤细胞球的过程。2 结果

2. 1 SSM和SFM中Caco-2细胞的形态 SSM中 的Caco-2细胞贴壁生长，呈圆形或椭圆形，形态均一， 透光性强。见图1。少数凋亡细胞悬浮。将SSM培 养并处于对数生长期的结肠癌Caco-2细胞移植于 SFM中，培养2% h后可产生少量体积较小松散的悬 浮肿瘤球，大部分细胞凋亡崩解，不能在SFM中生 长，培养72 h后细胞球增多，肿瘤球体积增大。见 图2。

细胞形态（细胞贴壁生长，100X)

2.2 CSCs交替在SSM和SFM中培养结果将

CSC@接种于SSM中，肿瘤细胞球分化为普通肿瘤细 胞，12 h后细胞开始贴壁，2% h后细胞完全贴壁，细胞 平贴培养板底并逐渐形成单细胞层，显微镜下观察与

A.无血清培养72 h (100X);B.无血清培养72 h#00X)

图2 倒置相差显微镜下观察SFM培养72h后的Caco-2细胞形态（细胞形成悬浮肿瘤球)

图3 倒置相差显微镜下观察CSCs接种于SSM中2% h后Caco-2细胞形态（细胞再次呈贴壁生长，100X)

3

讨 论

目前，结肠癌发病率位居世界第3位&]。尽管医

疗技术不断进步，但结肠癌的治疗方法仍以手术为 主，放、化疗，生物治疗为辅。虽然上述治疗方法在结 肠癌治疗中取得了一定的疗效，但并不能彻底治愈结 肠癌，原因在于结肠癌中存在一种数量极少的CSCs， 这些细胞可逃逸药物的杀伤作用，从而导致肿瘤耐 药、转移和复发。

CSCs学说早在十几年前被REYA等[10]第1次 提出，其认为肿瘤组织中存在少量的CSCs，这群细胞 与干细胞的特性惊人相似，均具有自我更新、多向分 化及无限增殖潜能，能驱动肿瘤的发生。后续有大量 证据显示，包括结肠癌在内的几乎所有实体瘤均包含 特有的CSCs亚群，其是肿瘤转移、复发及耐药的根 源。因此，结肠癌中CSCs将成为最有效的治疗靶点。 目前，正在研发专门针对结肠癌CSCs而不诱导正常 结肠组织毒性的药物[11]。那么如何分离、培养纯化的 CSCs成为研究结肠癌的关键。

有研究发现，无血清悬浮培养法利用的是“优胜 劣汰”的原理以达到分选目的。EGF、bFGF等生长因

子具有促进细胞增殖、帮助修复组织损伤等作用，可

代替血清供给营养又不会导致细胞分化，是有利于 CSCs增殖的重要生长因子。在添加了 ENF和bFNF 的SFM中，仅有少量祖细胞和处于未分化状态的 CSCs能存活下来，形成悬浮的肿瘤细胞球，这些形成 细胞球的CSCs在含血清培养基中可被诱导分化为成

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熟的肿瘤细胞[12];而大多数分化的肿瘤细胞因不能耐

受无血清环境而在数天内发生失巢凋亡，最终因死亡 而被淘汰。故而无血清培养法可达到初步富集CSCs 的目的。有研究通过无血清培养法，已成功制备了多 种 如胃癌 +,+@[1\"]。

为获取结肠癌本研究进行了无血清悬浮 培养。在无血清D*;*培养基中加人；G-、K-G-、 G!2 \"种生长因子，可有效地从CacF!细胞中培养分 离呈悬浮细胞球样生长的细胞，这部分肿瘤细胞球称 之为CSCs相关细胞（富集CSCs)，剩余的大多数肿瘤 细胞即肿瘤组成细胞增殖能力有限，不具有分化能 力，大部分细胞凋亡崩解，不能在SFM中生长。

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结肠癌CSCs的特点之一就是能在SFM中非贴 壁生长形成悬浮的肿瘤细胞球，其CSCs标志物—— Lgr5、CD4%、CD166等表达均较亲本细胞高[1%]。 ARAB-GA-RANI等[15]研究结果也显示，结肠癌 HT-29细胞株在SFM中培养数天后形成细胞球，其 CD133表达（8%%)远高于亲本细胞（25%)，且球体细 胞具有更强的抗辐射能力，因此，无血清培养方式可 使结肠癌CSCs维持其原始表型。朱玉德等™进行 的关于人脑胶质瘤CSCs初步研究也表明，人脑胶质 瘤细胞同样能在含生长因子的SFM中形成细胞球， 这种细胞球由于富集CSCs而被称为脑肿瘤细胞球。 虽然这种细胞的总体数量极少，但能克隆性生长，从 而产生不同表型的癌细胞亚群。

本研究结果显示，无血清培养法可使Caco-2细胞 中CSCs稳定传代，并保持其干细胞特性而不改变，截 止实验结束时已成功传代10代。YAMASAKI等™ 研究结果也显示，小鼠多能干细胞在SFM中能维持 未分化状态3年以上。此外，冯燕君等™研究发现， 在无血清培养条件下人结肠癌HCT116、HT29细胞株 分别在无血清培养的第5、天开始形成规则的球体。 本研究结果显示，Caco-2细胞培养2%h后便可产生少 量体积较小松散的悬浮肿瘤球，培养72 h后细胞球增 多、体积增大，与HCT116、HT29细胞株比较，Caco-2 细胞株更易形成肿瘤细胞球且所需时间更短，因此， Caco-2细胞系更适合作为结肠癌CSCs研究的模型。

综上所述，研究结肠癌CSCs有利于更好地理解 肿瘤复发、转移和耐药性产生的机制，从而制定更为 合理的治疗方案，所以，制备结肠癌CSCs是研究结肠 癌的关键。本研究通过无血清悬浮培养法成功从Ca­co-2 细胞中分离出结肠癌 CSCs 亚群，表明无血清悬 浮培养法是分选结肠癌CSCs的有效技术。此外，通 过与其他研究比较，作者认为，Caco-2细胞系特别适 合作为结肠癌CSCs研究的模型。然而，本研究仍有 不足之处，虽然对分离出的结肠癌CSCs亚群从形态 学、分化、自我更新、交替培养等方面进行了鉴定，但 仍应进一步判断其成瘤能力、耐药性等干细胞特性。

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(收稿日期2018-05-21

修回日期2018-09-11)