(19)中华人民共和国国家知识产权局
*CN103388015A*
(10)申请公布号(10)申请公布号 CN 103388015 A(43)申请公布日 2013.11.13
(12)发明专利申请
(21)申请号 201310313774.5(22)申请日 2013.07.24
(71)申请人甘肃华羚生物技术研究中心
地址730000 甘肃省兰州市城关区定西南路
225号
申请人兰州大学
甘肃华羚酪蛋白股份有限公司(72)发明人谢小冬 高维东 纪银莉 宋礼
文鹏程 孙文静 冯丹 刘恭何潇 葛静微(74)专利代理机构兰州振华专利代理有限责任
公司 62102
代理人张真(51)Int.Cl.
C07K 1/16(2006.01)C07K 7/06(2006.01)C07K 7/08(2006.01)
C12P 21/06(2006.01)
(54)发明名称
牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法(57)摘要
本发明利用胰蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备及分离纯化抗凝血肽，其步骤为：（1）调节反应
搅拌，使牦牛乳酪温度30～50℃，pH5.5～7.5，
蛋白溶解；（2）加胰蛋白酶水解，维持反应温度30℃，pH5.5～7.5，水解1～4小时；（3）升温至80～100℃，维持5～15分钟，灭活胰蛋白酶；（4）用5mol/L食用级盐酸调节pH 4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；（5）4000～10000g离心力，离心5～10分钟，离心除沉淀，留上清液；（6）喷雾干燥上清液；（7）利用葡聚糖凝胶柱对水解产物进行分离纯化；（8）采用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测各组分活性；（9）氨基酸序列检测：采用N端序列测定法检测牦牛乳酪蛋白抗凝血肽氨基酸序列。
权利要求书1页 说明书4页权利要求书1页 说明书4页
CN 103388015 ACN 103388015 A
权 利 要 求 书
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1.一种牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法，其特征是包括以下步骤：（1）溶解：称取牦牛乳酪蛋白10-50g，加水500mL，调节反应温度30～50℃，pH5.5～7.5，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；
（2）酶解：称取0.25g～2.5g胰蛋白酶加入，维持反应温度30～50℃，pH5.5～7.5，反应1～4小时；
（3）灭酶，升温至80～100℃，维持5～15分钟；（4）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；（5）离心：4000～10000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；（6）喷雾干燥：取离心上清液，采用喷雾干燥机，对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗凝血肽。
2.如权利要求1所述的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法，其特征是还包括以下步骤：
（7）分离纯化：配制浓度为1%～5%的步骤（6）得到的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽进行上样，利用Sephadex G-15分离纯化，洗脱液为磷酸缓冲液pH6.8、0.02mol/L，收集在280nm处具有吸收峰的组分；
（8）活性检测：采用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测各组分活性；（9）分子量及氨基酸序列测定：利用N端序列测定方法，确定四组抗凝血肽氨基酸序列结构，分别是来自a-S1酪蛋白91-100，8-22，4-22和β-酪蛋白177-183。
3.如权利要求1所述的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法，其特征在于所选用的分离纯化方式为葡聚糖凝胶柱分离。
4.如权利要求2所述的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法，其特征在于所述的确定四组抗凝血肽氨基酸序列分别是所述的a-S1酪蛋白91-100为YLGYLEQLLR；所述的a-S1酪蛋白8-22为HQGLPQEVLNENLLR；所述的a-S1酪蛋白4-22为HPIKHQGLPQEVLNENLL；所述的β-酪蛋白177-183为AVPYPQR。
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说 明 书
牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法
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技术领域
[0001]
本发明利用胰蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备及分离纯化抗凝血肽，属于生物技术
领域。背景技术
凝血是人体不可或缺的生理功能，但疾病凝血可诱发血栓，引发肺梗塞、脑血栓、
视网膜动静脉阻塞、心肌梗塞和四肢及周围血管栓塞。目前，心脑血管病是我国发病率、致残率和死亡率最高的疾病，调查显示近年来每1000人中就有1-3人患有血栓类，每12s就有一人因中风或心梗而倒下。
[0003] 心脑血管疾病已成为我国发病率致死率最高的疾病，其中大部分疾病与血栓相关。而临床上使用的肝素、香豆素、链激酶、尿激酶等物质易引发出血等副作用。从水蛭、蜱虫、钩口线虫、蛇毒和蜂毒中提取的抗凝溶栓活性物质具有良好的抗凝血效果，但毒副作用大。牦牛乳酪蛋白源生物活性肽因安全性高、易吸收，可以应用于抗血栓类产品的开发，用于血栓患者的辅助治疗。
[0004] 牦牛乳酪蛋白是以西北特有的资源“曲拉”为原料，通过提取纯化制备的蛋白质，由于酪蛋白疏水性氨基酸含量高，不易溶于水，溶于弱碱液，了其在食品中的广泛应用。酪蛋白通过水解后，可以释放出各种生理功能肽，这些肽主要含2-20个氨基酸残基，分子量小于6000Da，易溶于水，能大大提高酪蛋白的原有营养价值。
[0002]
发明内容
本发明的目的在于避免现有技术的不足，提供一种牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法。用胰蛋白酶水解牦牛乳酪蛋白制备抗凝血肽，采用葡聚糖凝胶柱对其进行分离纯化，得到纯度较高的酪蛋白抗凝血肽，从而实现了牦牛乳酪蛋白的深加工，同时也为心脑血管等疾病的预防与治疗提供一种安全、无毒副作用的新选择。牦牛乳酪蛋白抗凝血肽工艺简单，抗凝血活性明显，适合工业化推广生产。[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法，其主要特点是包括以下步骤：[0007] （1）牦牛乳酪蛋白；食品级。[0008] （2）溶解：称取牦牛乳酪蛋白10-50g，加水500mL，调节反应温度30～50℃，pH5.5～7.5，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解；[0009] （3）酶解：称取0.25g～2.5g胰蛋白酶加入，维持反应温度30～50℃，pH5.5～7.5，反应1～4小时；[0010] （4）灭酶，升温至80～100℃，维持5～15分钟；
[0005]
[0011] （5）沉淀酪蛋白：用5mol/L盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出；[0012] （6）离心：4000～10000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液；
[0013] （7）喷雾干燥：取离心上清液，采用喷雾干燥机，对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋
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说 明 书
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白抗凝血肽。
[0014] 所述的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法，还包括以下步骤：[0015] （8）分离纯化：配制浓度为1%～5%的步骤（6）得到的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽进行上样，利用Sephadex G-15分离纯化，洗脱液为磷酸缓冲液pH6.8、0.02mol/L，收集在280nm处具有吸收峰的组分；[0016] （9）活性检测：采用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测各组分活性；[0017] （10）分子量及氨基酸序列测定：利用N端序列测定方法，确定四组抗凝血肽氨基酸序列结构，分别是来自a-S1酪蛋白91-100，8-22，4-22和β-酪蛋白177-183。[0018] 所选用的分离纯化方式为葡聚糖凝胶柱分离。[0019] 所述的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法，所述的确定四组抗凝血肽氨基酸序列分别是所述的a-S1酪蛋白91-100为YLGYLEQLLR；所述的a-S1酪蛋白8-22为HQGLPQEVLNENLLR；所述的a-S1酪蛋白4-22为HPIKHQGLPQEVLNENLL；所述的β-酪蛋白177-183为AVPYPQR。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] 1.本发明采用牦牛乳酪蛋白为原料，原料蛋白含量高，价格低，间接降低了生产成本；同时酶水解牦牛乳酪蛋白，产物溶解性好，易吸收，在提高了牦牛乳酪蛋白的营养价值的同时，使其具有预防血栓形成的功能。[0022] 2.食源牦牛乳酪蛋白抗凝血性肽，与其他来源的抗凝血性产品相比，安全性高，毒性较小，不存在出血等副作用。
[0023] 3.利用葡聚糖凝胶分离纯化牦牛乳酪蛋白抗凝血肽，实现了抗凝血肽组分的分离，确定了抗凝血肽的分子量及氨基酸序列结构。
[0024]
4.制备工艺简单，环保安全，易于实现工业化生产。
具体实施方式
[0025] 以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。[0026] 实施例1：一种牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法，包括以下步骤：[0027] （1）牦牛乳酪蛋白：购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级。[0028] （2）溶解：称取牦牛乳酪蛋白10g，加水400mL，调节反应温度30℃，pH5.5，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。[0029] （3）酶解：胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，称取0.25g胰蛋白酶加入，维持反应温度30℃，pH5.5，反应1小时。[0030] （4）灭酶，升温至80℃，维持15分钟。[0031] （5）沉淀酪蛋白：用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出。
[0032] （6）离心：4000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液。[0033] （7）喷雾干燥：取离心上清液，利用喷雾干燥机，对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗凝血肽，得到干粉8.31g，得率83.1%。[0034] （8）分离纯化：配制0.1g/mL的喷雾干燥步骤（7）得到的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽
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说 明 书
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进行上样，上样3mL，利用Sephadex G-15进行分离，洗脱液为磷酸缓冲液（pH6.8、0.02mol/L），收集280nm处具有吸收峰的组分，共60管。[0035] （9）抗凝血肽活性测定：对各组分进行抗凝血活性检测，活性最高组分的溶解圈直径19.30mm，抗凝血效价单位数可达903.6U/mg。[0036] （10）对活性组分进行分子量及氨基酸序列测定：利用质谱及N端序列测定方法，确定分离组分中存在四组氨基酸序列，分别是来自a-S1酪蛋白91-100（YLGYLEQLLR），a-S1酪蛋白8-22（HQGLPQEVLN ENLLR），a-S1酪蛋白4-22（HPIKHQGLPQEVLNENLL）和β-酪蛋白177-183（AVPYPQR）。[0037] 实施例2：一种牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法，包括以下步骤：[0038] （1）牦牛乳酪蛋白：购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级。[0039] （2）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白25g，加水500mL，调节反应温度40℃，pH6.5，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。[0040] （3）加胰蛋白酶：胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，称取0.25g胰蛋白酶加入，维持反应温度40℃，pH6.5，反应2小时。[0041] （4）灭活胰蛋白酶，升温至90℃，维持10分钟。[0042] （5）沉淀酪蛋白：用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出。
[0043] （6）离心：8000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液。[0044] （7）喷雾干燥：取离心上清液，采用喷雾干燥机对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋白抗凝血肽，得到干粉20.52g，得率82.1%。[0045] （8）分离纯化：配制0.1g/mL的喷雾干燥干燥步骤（7）得到的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽进行上样，上样3mL，利用Sephadex G-15进行分离，洗脱液为磷酸缓冲液（pH6.8、0.02mol/L），收集280nm处具有吸收峰的各组分，共60管。[0046] （9）活性检测：采用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测各组分活性，活性最高组分的溶解圈直径12.75mm，抗凝血效价单位数为516.4U/mg。[0047] （10）对活性组分进行分子量及氨基酸序列测定：利用质谱及N端序列测定方法，确定分离组分中存在四组氨基酸序列，分别是来自a-S1酪蛋白91-100（YLGYLEQLLR），a-S1酪蛋白8-22（HQGLPQEVLN ENLLR），a-S1酪蛋白4-22（HPIKHQGLPQEVLNENLL）和β-酪蛋白177-183（AVPYPQR）。[0048] 实验例3：一种牦牛乳酪蛋白抗凝血肽的制备方法，包括以下步骤：[0049] （1）牦牛乳酪蛋白：购自华羚酪蛋白股份有限公司，食品级。[0050] （2）牦牛乳酪蛋白溶解：称取牦牛乳酪蛋白50g，加水500mL，调节反应温度50℃，pH7.5，搅拌，使牦牛乳酪蛋白溶解。[0051] （3）加胰蛋白酶：胰蛋白酶购自北京格源天润生物技术有限公司，称取0.25g胰蛋白酶加入，维持反应温度50℃，pH7.5，反应4小时。[0052] （4）灭活胰蛋白酶，升温至100℃，维持5分钟。[0053] （5）沉淀酪蛋白：用5mol/L食用级盐酸调节pH到4.6，使酪蛋白在其等电点处析出。
[0054] （6）离心：10000g离心力，离心除去酪蛋白沉淀，留上清液。
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[0055] （7）喷雾干燥：取离心上清液，利用喷雾干燥机，对产品进行喷干，得到牦牛乳酪蛋
白抗凝血肽。[0056] （8）分离纯化：配制5%浓度喷雾干燥步骤（7）得到的牦牛乳酪蛋白抗凝血肽进行上样，利用Sephadex G-15进行分离，洗脱液为磷酸缓冲液（pH6.8、0.02mol/L），收集280nm处具有吸收峰的组分。
[0057] （9）活性检测：采用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测各组分活性。活性最高组分的
溶解圈直径22.75mm，抗凝血效价单位数为1016.4U/mg。[0058] （10）分子量及氨基酸序列测定：利用质谱和N端序列测定方法，对活性组分进行分子量及氨基酸序列测定：利用质谱及N端序列测定方法，确定分离组分中存在四组氨基酸序列，分别是来自a-S1酪蛋白91-100（YLGYLEQLLR），a-S1酪蛋白8-22（HQGLPQEVLN ENLLR），a-S1酪蛋白4-22（HPIKHQGLPQEVLNENLL）和β-酪蛋白177-183（AVPYPQR）。[0059] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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