间接ELISA检测药物抗体效价
一、目的：掌握该方法及应用
二、原理：本实验依据抗原抗体的特异性、可逆性反应为基本原理进行设计，在聚苯乙烯板（酶标板）上包
被人工抗原（OVA-Hapten，1-10ug/mL），包被抗原和标准品竞争血清中抗体进行反应形成抗原抗体复合物，如果标准品浓度高，结合到包被原上的抗体少（反之亦然），洗板则洗掉。加入酶标二抗（RaMIG-HRP）后，用四甲基联苯胺（TMP）底物显色，显色越浅，吸收值（A450）越小，阻断效果越好，抗体特异性越高，反之，显色越深，以此来检测样本中抗体的特异性。 三、实验材料 （一）药品试剂
1.包被原 OVA-Hapten；2.血清抗体；3. RaMIG-HRP；4. 3、4号酶底物溶液；5.反应终止液2M H2SO4 ；6封闭液 5%猪阴性血清+95%PBST；7 标准品100-10ng/mL。 （二）仪器设备 1.微量加样器；2.酶标板 四、操作步骤 1.包被
（1）包被酶标板：方阵滴定法选择工作浓度（教师做），包被浓度2ug/mL。（2）包被稀释液的配制：1.59gNaCO3+2.94gNaHCO3+1L双蒸水即可；（3）加样：100uL/孔；4.温育：37℃ 2 h； （5）洗板：用PBST洗板3次，每次间隔3min。 2.封闭
（1）封闭液的配制：95%PBST+5%猪阴性血清；（2）加样：250uL/孔（3）温育：37℃ 1h；也可4℃过夜。（4）PBST洗板3次，每次间隔3min。 3.加一抗血清
（1）铺底：封闭液铺底，50uL/孔，12孔全加；（2）加标准品：第一孔加稀释过（100ng/mL）的标准品50uL/孔，之后倍比稀释至第10孔弃去，11孔作阳性对照（2）加一抗：加稀释过的抗血清（1:1000）50uL/孔，至第11孔， 12孔不加作为空白对照;（3）温育：37℃ 30min；（4）洗板：PBST洗板3次，每次间隔3min。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 孔数 封闭液铺底 mAb效价 观察结果 50 200 50 400 50 800 50 1600 50 3200 50 00 50 12800 50 50 50 50 50 4.加酶标二抗（1）稀释：用封闭液将RaMIG-HRP稀释浓度为1:500；（2）加样：50uL/孔；（3）温育：37℃ 25min；（4）洗板：PBST洗板3次，每次间隔3min。
5.显色（1）加入酶底物3、4号混合液60uL/孔；（2）计时：10min；（3）结果判定：根据各空的显色情况，以最后显色空的稀释倍数为抗体效价，以肉眼判断显色明显的孔作为mAb的工作浓度。6.终止反应：加入终止液50uL/孔
注：软板包被50uL/孔，硬板100 uL/孔。
