1、创新项目申报书-2010年

项目编号：

大学生科技创新项目

申 报 书

创新项目名称： Hepcidin在脑铁代谢中的作用

及其应用前景研究

创新项目负责人： 项目负责人专业： 临床医学 学校名称： 温州医学院 申报日期： 2010 年 12 月 20 日

浙江省大学生科技创新活动计划（新苗人才计划）实施办公室 制

填写说明

一、申报书要按照要求，逐项认真填写，填写内容必须实事求是，表达明确严谨。

二、格式要求：申报书中各项内容以Word文档格式填写，表格中的字体为小四号仿宋体，1.5倍行距；表格空间不足的，可以扩展或另附纸张；均用A4纸双面打印，于左侧装订成册。

三、申报书由所在学校领导审查、签署意见并加盖公章后，一式2份（均为原件），报送至团学校部。

一、项目简介 项 目 概 况 项目名称 项目性质 项目来源 起止时间 Hepcidin在脑铁代谢调节中的作用及其应用前景研究 （）基础研究 （√）应用基础研究 （）自主立题 （√）教师指导选题 自 2011 年 6 月 至 2012 年 6 月 项目状况 1√研发阶段 2、中试阶段 3、批量（规模）生产（选项打√） 申 姓名 请 所在 人 院系 项 目 组 主要成员 项 目 指 导 教 师 姓名 刘重斌 杜友爱 主要研究方向 性 别 出生 年月 入学 年月 仁济学院 姓名 联系 电话 年龄 性 别 38 58 电子 信箱 专业 具体分工 1971.12 1951.9 男 出生 性 别 男 年月 营养代谢生理 近三年获奖成果：国家级__等奖___项，省部级_三_等奖5_项 近三年科研经费____20________万元，年均____5_______万元 机体多种疾病的发生与铁超载有关，但铁在脑内的代谢目项 目 主 要 内 容 简 介 前尚不明确。本项目将确证hepcidin (铁调素) 是否在脑的广泛区域 (主要集中在脉络丛上皮细胞) 有表达？探究hepcidin在脑铁代谢调节中的作用，为脑铁代谢调节研究打开一个新的广阔的领域。同时，采用基因工程技术人工合成hepcidin，探究其治疗脑铁超载的应用前景，为铁代谢紊乱疾病治疗的药物开发打下基础。 二、项目的研究目的及意义 1、申请项目的必要性、目的及意义 元素铁由于其独特的化学反应活性，在维持细胞和机体正常代谢过程中起着至关重要的作用。铁代谢紊乱性疾病影响着数以亿计人口，最为人们所熟知的是，铁缺乏可引起缺铁性贫血，而铁过多将导致血色素沉着症。 近年来研究表明，铁代谢紊乱造成的危害并不局限于此，机体多种疾病的发生与铁超载有关，神经退行性疾病如帕金森病 (PD)、阿尔茨海默病 (AD)、铁源性心脏病和慢性肝纤维化等。铁在脑内参与许多重要的生物代谢过程，包括三磷酸腺甘、DNA和多种单胺类神经递质的合成等，但铁在脑内的摄取、转运、储存、利用及其机制等目前尚不明确。 在临床上，常采用放血疗法或给予去铁敏等铁螯合剂治疗铁超载，然而长期跟踪显示此种疗法并不能从根本上治疗铁超载性疾病，且副作用很大。因此，寻找和开发治疗铁超载疾病的有效新药成为一项刻不容缓的任务。 脑铁代谢与外周铁代谢有很多共同点，但较外周更为复杂。2001年，Park和Pigeon等同时发现了一种铁负性调节激素- - hepcidin (Hepc)，为肝脏合成并富含半胱氨酸的抗菌多肽。Hepc信号分子在脑的广泛区域中有无表达？哪些区域有表达？如有表达，其具体作用是什么？作用途径和机制又是如何？因此，探究hepcidin在脑的区域表达及其在脑铁代谢调节中的作用，将为脑铁代谢调节研究打开一个新的广阔的领域。 铁代谢蛋白异常表达是脑铁增高的主要原因。增高的脑铁启动机体级联放大机制，最终导致神经元死亡，诱发一系列神经退行性疾病和脑衰老疾病等。而降低脑铁含量的方法和药物可以起到防治铁超载引起的中枢神经系统老化的效果。随着人类对hepcidin在铁代谢调节中作用的认识，将其开发为治疗铁超载疾病的新药已成为研究的焦点。 目前，主要有三种途径可以获得外源性hepcidin：高效液相色谱法从尿液中提取、人工化学合成及基因工程制药。采用高效液相色谱法从尿液中分离的hepcidin含量少，只能满足科研工作需要。人工化学合成过程工序繁杂，产量也极低。由于高效液相色谱法和人工化学合成的局限性，目前采用基因工程技术合成重组hepcidin成为各国研究开发的主流，只可惜目前尚未有成品面世，多数研究还在实验室进行。 2007年，我们科研团队的实验室采用高效液相色谱法从人尿液中成功分离得到hepcidin，为含20和25个氨基酸的多肽，并用作治疗大鼠铁代谢紊乱疾病药物的静脉注射剂。国外学者Wallace和Gagliardo等分别于2006、2008年采用基因工程技术合成了与天然hepcidin具有相同活性的hepcidin。2009年，我们的实验室为了提高hepcidin的表达量，试图利用缺陷性腺病毒作为基因载体，将hepcidin基因重组入腺病毒中，载体系统Adeasy-1是缺陷性腺病毒的骨架质粒，通过穿梭质粒Ad-track-CMV将外源性基因与病毒骨架整合，包装出具有广泛感染性的重组腺病毒。包装成功的重组腺病毒在一般的细胞内不能复制，具有安全、高效、简单易行等优点。实验的成功将为广泛开展铁代谢紊乱疾病治疗的药物开发临床前研究打下一个重要的基础。 2、项目的背景、主要内容、技术水平及应用范围 项目的背景： 衰老 (aging) 是在生命进程中，机体的组织器官出现形态和功能的退变乃至老化的过程。脑是衰老过程中最突出的器官，也是人和动物老年性功能障碍的主要病灶之一。今天人们已经认识到许多脑衰老疾病与铁元素代谢有关，神经退行性疾病如帕金森病 (PD)、阿尔茨海默病 (AD) 等越来越引起人们的关注。自由铁能通过Fenton反应生成具有高度反应性的羟自由基，导致氧化应激，从而损害机体的一些基本成分，如脂质、蛋白、DNA等，最终导致细胞损伤和凋亡。 中枢神经系统主要通过血-脑屏障(Blood-brain barrier，BBB) 和血-脑脊液屏障(Blood-cerebrospinal barrier，BCB) 与系统循环隔开。血-脑脊液屏障位于脑室脉络丛 (Choroid plexus) 的血液与脑脊液之间，由脉络丛毛细血管内皮、基膜和脉络丛上皮细胞组成。脉络丛上皮细胞是血-脑脊液屏障的结构基础，呈绒毛样，具有重要的物质转运功能。早期的研究表明，流经脉络丛毛细血管的血流率大约是脑其他区域的5倍，经5-6小时就可更新50%的脑脊液，每昼夜大概更新4-5次。脉络丛在改变脑脊液循环和物质转运中发挥重要的调节作用。基于脉络丛的结构和其在物质转运的特殊性，我们推测，脉络丛可能是铁转运出脑神经细胞最主要的途径。 自2001年，Park和Pigeon等发现肝脏合成的铁负性调节激素- - hepcidin 以来，现已证实hepcidin可与十二指肠上皮细胞和巨噬细胞表面的膜铁转运蛋白Fpn 1结合，诱导Fpn 1内吞并降解，从而减少十二指肠铁吸收和巨噬细胞铁释放，降低血清铁含量，最终降低机体铁水平。另外，hepcidin对维持铁稳态起重要作用的肠上皮细胞、巨噬细胞及骨髓的其他铁转运蛋白的表达也有调节作用。 2008年，我们的科研团队在实验研究中发现，转铁蛋白DMT 1、Fpn 1和Dcyt b (Duodennal cytochrome b) 在大鼠脉络丛上皮细胞中有高度表达，脉络丛上皮细胞中CP和ferritin也有高度表达。接着，我们通过提取大鼠脉络丛上皮细胞总mRNA发现，hepcidin mRNA表达也很高。转铁蛋白在脉络丛上皮细胞中有高度表达，说明脉络丛对脑铁代谢是有重要作用的。Hepcidin在外周是由肝脏分泌的，但脉络丛上皮细胞中高表达的hepcidin是由外周进入的还是脑内神经元或胶质细胞产生的呢？脉络丛上皮细胞中hepcidin与其它参与脑铁代谢的转铁蛋白的关系究竟如何？这些问题目前尚不清楚。如果通过实验证实了我们的推测并获得直接的证据，将为脑铁代谢调节研究打开一个新的广阔的领域。 早先的研究显示，铁负荷血色病 (Hemochromatosis, HC) 发病中均有hepcidin的减少，导致机体铁吸收的增加，而在转染hepcidin基因的Hfe-/-小鼠，hepcidin组成性表达能防止Hfe-/-小鼠的铁超负荷；酗酒和慢性丙肝患者可下调hepcidin转录，肠道铁转运蛋白表达增加，最终导致肝脏铁沉积；缺氧和炎症可以诱导心脏hepcidin表达升高，而相应补充外源性的hepcidin却可以很好地延缓疾病的进展及并发症的发生。基于hepcidin在外周有降低机体铁水平的作用，结合我们实验室前期研究发现在脉络丛上皮细胞中有hepcidin高表达的作用靶点- -转铁蛋白DMT 1和Fpn 1，我们推测它也可能成为一种治疗脑铁超载引起的神经退行性疾病的新药。我们为了提高Hepc的表达量，利用缺陷性腺病毒作为基因载体，采用安全、高效、简单的基因工程技术人工合成hepcidin。实验的成功将为广泛开展铁代谢紊乱疾病治疗的药物开发临床前研究打下一个重要的基础。 项目主要内容： 本项目的研究内容之一：确证hepcidin是否在脑的广泛区域 (主要集中在脉络丛上皮细胞) 有表达？脉络丛hepcidin与其它脑铁转运蛋白的关系如何？从整体、细胞和分子水平上探究hepcidin在脑铁代谢调节中的作用，获取直接的证据。 本项目的研究内容之二：采用基因工程技术合成hepcidin，并探究其治疗脑铁超载的应用前景，为铁代谢紊乱疾病治疗的药物开发打下基础。 项目技术水平及应用范围： 3、实施该项目所具备的基础、优势和风险 申请者攻读硕士和博士期间，一直从事机体能量代谢和微量元素代谢生理的研究。工作后主要从事机体铁吸收、转运、储存、利用的，脑铁代谢与神经退行性疾病，脑衰老保护等基础和应用方面的研究。申请者曾两次(2008.3-2008.6，2009.6-2009.12) 到加拿大多伦多大学医学生理系进修学习，开展铁负荷与心脏疾病、神经退行性疾病等方面的研究，与国内外铁代谢同行专家建立了较好的业务合作和交流关系。近期，申请者和科研团队主要成员在铁代谢生理等方面先后主持或参与浙江省教育厅 (DMT1、Fpn1在小肠血管内皮细胞中的表达及其在铁转运中的作用2070993)、浙江省自然科学基金 (Frataxin在铁代谢中的作用及抗氧化机制研究Y2081075；线粒体顺乌头酸酶（ACO2）活性的调节机制及其与细胞衰老的相关性研究Y2100582) 、浙江省科技厅 (锌对酒精性肝损伤的治疗及其分子机制2009F80004) 和校创新型人才启动基金 (硝苯地平在铁负荷治疗中的新作用及其与DMT1的关系QIJ06005) 等项目的研究。比较系统掌握了基因工程技术、细胞培养、激光共聚焦显微技术、免疫组织化学、原位杂交、荧光定量实时PCR、Western-bloting等铁代谢研究技术。本项目的研究是申请者长期研究工作的延续。申请者所在的科研团队后期的工作可以尝试研究铁、锌稳态失衡在糖尿病和肿瘤发生发展中的作用并寻找相应的防治手段，筛选和鉴定出铁、锌稳态的新基因。 ① Hepcidin在脑的区域表达及年龄变化初步研究 2010年，我们的研究生在对hepcidin在中枢神经系统表达研究中发现，hepcidin在脑的广泛区域 (包括大脑皮质、海马、间脑、小脑、中脑、脑桥和纹状体) 有高度表达 (参考下图3)，而且随着动物年龄的增加，大脑皮质、纹状体和海马hepcidin mRNA表达显著增加 (参考下图4)。但进一步的确证还有很多工作要做。 图3 hepcidin mRNA在脑内的表达 图4 hepcidin mRNA表达与动物年龄的关系 ③ 线粒体顺乌头酸酶 (ACO2) 在脑铁代谢中的功能研究 线粒体不仅是能量产生的主要场所，也是机体产生氧自由基 (ROS) 的主要场所。线粒体顺乌头酸酶是ROS敏感的酶，也是一种含[4Fe-4S]铁硫蛋白。线粒体顺乌头酸酶的失活主要有两个严重的后果：使Fe释放，进一步促发羟自由基的级联反应，加重细胞的氧化压力；线粒体能量产生和铁代谢障碍，最终导致细胞活性下降。2009年，我们在研究中发现， ROS代谢失衡和线粒体内铁代谢障碍共同影响了顺乌头酸酶的活性，进一步加重线粒体衰老以及细胞衰老的进程。(结果在整理中，待发表)。 ④ 铁负荷代谢疾病治疗的新途径研究 2008年，我们的研究生在寻找机体铁负荷代谢疾病治疗的新途径研究中发现，硝苯地平能降低铁负荷大鼠血脂中的TC和LDC，降低脂质过氧化程度。组织学染色发现，注射硝苯地平的铁负荷实验组大鼠中，肝实质、肾实质和脾实质铁黄素沉积有明显减少的趋向 (参考下图9)。血清中铁、铁蛋白以及硒含量显著下降。肝组织中hepcidin mRNA表达显著下降，小肠组织中Fpn 1 mRNA表达显著增加 (参考下图10)。我们的研究认为，硝苯地平可能是机体铁负荷等相关代谢疾病治疗的一种新药。但其作用的机制和具体途径，与转铁蛋白的关系如何有待进一步的研究。 4、项目计划目标 本项目获批后计划3年（2011.1-2013.12）分年度实施，遵从浙江省自然科学基金委和各级管理部门的各项条例，及时将研究进展向上级主管部门汇报，使项目不断得到上级主管部门的指导和支持。具体实施的进度时间安排如下： 2011.1-2011.12: 确证hepcidin是否在脑的广泛区域有表达？验证hepcidin是脑铁代谢调节中的一个关键信号分子。 2012.1-2012.12: 研究脉络丛和hepcidin在脑铁代谢调节中的作用。 2013.1-2013.12: 采用基因工程技术合成重组hepcidin，并探究其治疗脑铁超载的应用前景。 三、预期成果、知识产权形成及经济、社会效益分析 1、项目的预期成果及知识产权归属情况 通过本课题以上的研究可以达到以下几方面的预期研究结果： ① 确立脉络丛和hepcidin 在神经细胞铁代谢过程中的确切功能。结果将为脑铁代谢平衡调节研究提供新线索，打开一个新的广阔的领域。 ② 采用基因工程技术合成hepcidin，为脑铁代谢紊乱引起的神经退行性疾病等脑衰老的治疗提供新方法和理论依据，开创新的靶点；也为铁代谢紊乱疾病治疗的药物开发打下基础。 其成果可在国内外高级别的学术刊物上发表至少3篇论文，其中高影响因子的SCI收录论文1篇，并参加国内外学术交流。另外培养研究生1-2名。 2、项目的市场前景分析 3、项目的盈利能力分析及财务预算 4、项目的社会效益分析

四、项目实施进度方案 为了顺利完成以上3方面的研究内容，具体设计的研究方案、关键技术和研究路线如下： 4.2.1 研究内容一采用的研究方案： ① 采用实时荧光定量PCR对脑的广泛区域（主要包括大脑皮质、小脑、脑桥、嗅球、下丘脑、海马和纹状体等）hepcidin mRNA表达进行定量研究。同时，采用不同年龄段的SD大鼠（出生后1、3、9、28、72 周）研究hepcidin mRNA表达与动物年龄的关系。 ② 采用Western-bloting在蛋白水平上加以验证。 ③ 采用免疫组织化学 (常规的ABC法) 和实时荧光定量PCR对脉络丛上皮细胞中TfR1、DMT1、Dcytb、Fpn1、Hephaestin、CP、Ferritin-L、Ferritin-H 等转铁相关蛋白及Hepcidin的表达进行定位和定量研究。同时，在蛋白水平上进一步加以验证。 4.2.2 研究内容二采用的研究方案： 整体水平的研究： ① 铁超载动物模型的构建和饲养 成年雄性SD大鼠按体重随机分为8组，分别喂饲铁含量为50、100、200、500、1000、3500 mg · kg-1的饲料8 周。饲料配方采用先去除基础饲料无机盐中的铁，后在饲料中添加不同剂量的硫酸亚铁 (FeSO4·7H2O)，配制不同铁含量的饲料。其中配制的50 mg · kg-1的饲料为基础饲料对照组。 ② 采用实时荧光定量PCR测定不同铁负荷SD大鼠脉络丛上皮细胞中TfR1、DMT1、Dcytb、Fpn1、Hephaestin、CP、Ferritin-L、Ferritin-H等转铁相关蛋白及脉络丛上皮细胞中hepcidin mRNA的表达变化 (与正常对照组动物比较)。 细胞和分子水平的研究： ① 细胞原代培养和分组设计 a. PC12细胞原代培养 采用新生SD大鼠的大脑皮层和海马组织，先用冰冷的Krebs’ solution溶液冲洗2-3次，同时完全去除组织中血管和质膜后，加入10 ml 0.05%胰蛋白酶37℃水浴中消化10-15 min，终止消化，离心，弃上清。经洗涤后用营养液分散制成细胞悬液，按合适的浓度分瓶培养。用含有B-27培养基因子的DMEM培养液再悬细胞，培养24 h，每隔2 d更换培养液一次，持续6 d后，用PBS冲洗三次，每孔板中再加入1 ml DMEM培养液。 b. PC12细胞实验设计分组 培养的PC12细胞随机分为2组，分别加入2.5 μg／ml我们实验室人工合成的hepcidin或灭菌处理的0.9%生理盐水37℃恒温箱共培养12 h后，用于测定细胞铁含量及释放、转铁蛋白Fpn1及hepcidin mRNA的表达变化。 ② 铁含量及铁释放检测 a. 细胞中可变铁池 (Labile iron pool，LIP) 中铁含量检测 分析细胞总铁含量，采用ferrozine (一种铁专一的显色剂) 来测定，分光光度计5 nm检测。采用荧光探针Calcein (可被Fe3+淬灭)，同时加入高亲脂性铁螯合剂水杨醛异烟酰腙 (SIH) 在激光共聚焦显微镜激发光(488 nm)，发射光 (535 nm)下荧光检测细胞胞浆中铁和线粒体中铁含量变化。 b. 细胞铁释放测定 准备好55FeCl3培养液 (采用55FeCl3和FeSO4按1：10摩尔浓度比混合，同时加入50倍摩尔浓度的2-巯基乙醇和0.32 M蔗糖溶液)。用PBS冲洗三次后的PC12原代培养细胞在55FeCl3培养液（1 mM）37℃恒温箱培养60 min 后，用冷的PBS冲洗三次后，加入1 ml缓冲盐溶液，继续在37℃恒温箱培养30 min 后，测定细胞放射性标记铁的释放。铁的释放率计算公式：55Fe%= (cpm in supernatant) /( cpm in supernatant + cpm in cells) × 100%。 ③ 转铁蛋白Fpn1及hepcidin mRNA表达测定 采用蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交等标准几部分组成的Western-bloting测定方法，测定PC12细胞中Fpn1蛋白的表达变化；Hepcidin mRNA测定采用实时荧光定量PCR的方法。 4.2.3 研究内容三采用的研究方案： ① 基因工程技术合成重组hepcidin 利用缺陷性腺病毒作为基因载体，将小鼠的hepcidin基因整合重组到腺病毒中，利用载体系统Adeasy-1是缺陷性腺病毒的骨架质粒，通过穿梭质粒Ad-track-CMV将外源性基因与病毒骨架整合，包装出具有广泛感染性的重组腺病毒。经纯化分离出hepcidin。这种包装成功的重组腺病毒在一般的细胞内不能复制，具有安全、高效、简单易行等优点。 ② 园二色光谱检测和生物活性测定 通过园二色光谱检测重组的hepcidin与天然的hepcidin是否具有相同的分子量和二级结构；酶切后所得重组的hepcidin经抑菌圈实验检验其抗微生物活性。 ③ 铁超载动物模型的构建与研究内容二中介绍的研究相同。 ④ 侧脑室注射，导入外源性人工合成的hepcidin 侧脑室注射的动物采用出生后9 周的雄性铁超载SD大鼠，按体重随机分为4组。三维脑立体定位仪定位后，确定右侧脑室坐标，用颅钻钻孔，对照组注射0.9%生理盐水5 μl，其余3组分别通过侧脑室注射浓度为分别为0.2 、1和 5 μg/μl实验室人工合成的hepcidin 5 μl。30 s注完，留针10 min。 ⑤ 转铁蛋白检测 12 h后采用免疫组织化学和Western-bloting测定和分析大脑皮质、海马和纹状体等组织及脉络丛上皮细胞中DMT1、Fpn1、Ferritin-L和Ferritin-H等转铁蛋白的表达变化。 五、项目组承诺

承 诺 书 以上所填内容真实可靠，本项目组承诺：该项目立项后，将严格遵守有关规定、遵守本申报书和预算表中规定的条款和内容，保证按计划进度完成项目任务。 项目组全体成员（签章）： 年 月 日 六、学校审核意见： 负责单位（公章）： 年 月 日 七、专家组审核意见 专家组组长签章： 年 月 日 八、实施办公室审核意见 公章： 年 月 日